全人源抗狂犬病病毒糖蛋白抗體的制備及鑒定.pdf

1、狂犬病是一種急性的人獸共患中樞神經(jīng)系統(tǒng)傳染病，主要表現(xiàn)為外周神經(jīng)炎癥和急性腦炎。該病是由狂犬病病毒(rabies virus，RV)感染引起，且一旦發(fā)病尚無(wú)有效治療措施，死亡率幾乎為100％。據(jù)世界衛(wèi)生組織(World HealthOrganization，WHO)統(tǒng)計(jì)，全球每年至少50萬(wàn)人接受狂犬病病毒暴露后的預(yù)防，狂犬病死亡人數(shù)約5.5萬(wàn)人。近年來(lái)，我國(guó)狂犬病疫情居高不下，成為受狂犬病危害最嚴(yán)重的國(guó)家之一。因此，研制有效防治狂犬病的

2、藥物具有極其重要的意義。目前臨床上對(duì)于狂犬病三級(jí)暴露后的治療包括接種狂犬病疫苗和注射抗狂犬病病毒免疫球蛋白(WHO，2005)?？箍袢〔《久庖咔虻鞍?rabiesimmunoglobulin，RIG)包括人抗狂犬病病毒免疫球蛋白(human rabiesimmunoglobulin，HRIG)和馬抗狂犬病病毒免疫球蛋白(equine rabiesimmunoglobulin，ERIG)。但HRIG價(jià)格昂貴，ERIG存在異種蛋白引起過(guò)敏

3、反應(yīng)和潛在病毒感染的風(fēng)險(xiǎn)，且HRIG和ERIG均不易大量制備，因此急需研制其他血清替代品。全人源單克隆抗體為狂犬病的預(yù)防和治療提供了新的解決方法，已成為國(guó)內(nèi)外生物制藥領(lǐng)域?qū)＜业墓沧R(shí)。
　　目的：應(yīng)用Bac-To-Bac桿狀病毒昆蟲(chóng)細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)，構(gòu)建狂犬病病毒糖蛋白(rabies virus glycoprotein，RVG)的真核表達(dá)載體rBacmid-RVG，表達(dá)并純化重組RVG蛋白(recombinant rabies vir

4、us glycoprotein，r-RVG)，免疫轉(zhuǎn)人IgM基因小鼠，篩選制備全人源抗重組RVG蛋白單克隆抗體，為進(jìn)一步研制用于狂犬病防治的抗體藥物奠定基礎(chǔ)。
　　方法：⑴以GenBank發(fā)表的狂犬病病毒CVS-11株糖蛋白基因序列為依據(jù)，設(shè)計(jì)特異性引物，提取病毒RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA，擴(kuò)增RVG基因，將PCR產(chǎn)物和pFastBac-GP67B同時(shí)經(jīng)雙酶切后回收連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞，篩選重組質(zhì)粒pFastBac-

5、GP67B-RVG。將陽(yáng)性重組質(zhì)粒pFastBac-GP67B-RVG轉(zhuǎn)化DH10Bac感受態(tài)細(xì)胞，PCR鑒定陽(yáng)性后抽提重組表達(dá)質(zhì)粒rBacmid-RVG。⑵rBacmid-RVG轉(zhuǎn)染昆蟲(chóng)細(xì)胞Sf-9，待細(xì)胞出現(xiàn)明顯病變后分別收集培養(yǎng)上清和細(xì)胞沉淀。細(xì)胞沉淀提取DNA，RVG特異性引物PCR擴(kuò)增分析。Westernblot檢測(cè)重組RVG的表達(dá)。His TrapHP親和柱純化重組RVG，SDS-PAGE電泳檢測(cè)。重組RVG蛋白免疫小鼠，同

6、時(shí)設(shè)置陰性對(duì)照組和空白對(duì)照組。間接ELISA方法檢測(cè)小鼠血清抗重組RVG蛋白IgG抗體效價(jià)。⑶以重組RVG蛋白作為抗原，采用皮下多點(diǎn)及腹腔注射法免疫轉(zhuǎn)人IgM基因小鼠，采用雜交瘤技術(shù)篩選全人源抗重組RVG蛋白雜交瘤細(xì)胞株。⑷采用雙抗體夾心ELISA實(shí)驗(yàn)鑒定單抗的人源性及抗體類型，并對(duì)其特異性及與滅活狂犬病病毒CVS-11株的結(jié)合能力進(jìn)行鑒定。
　　結(jié)果：①將提取狂犬病病毒CVS-11株的RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，用RVG特異性引物擴(kuò)

7、增后片段大小在1500 bp左右。將陽(yáng)性重組質(zhì)粒pFastBac-GP67B-RVG雙酶切后，含有pFastBac-GP67B(4700 bp)和RVG(1500 bp)兩個(gè)條帶;用M13通用引物對(duì)重組表達(dá)質(zhì)粒rBacmid-RVG進(jìn)行PCR鑒定，擴(kuò)增的片段大小為3900 bp，與預(yù)期相符。②重組rBacmid-RVG通過(guò)Roche試劑轉(zhuǎn)染進(jìn)昆蟲(chóng)細(xì)胞Sf-9，Westem blot檢測(cè)顯示病毒上清液和細(xì)胞沉淀裂解物在58 kDa處均有特

8、異性條帶。從病毒感染的Sf-9細(xì)胞中提取總DNA，用RVG特異引物擴(kuò)增產(chǎn)物有1500 bp左右，表明重組質(zhì)粒rBacmid-RVG基因被轉(zhuǎn)染至Sf-9細(xì)胞。以His-TrapHP親和層析柱純化重組RVG蛋白在58 kDa處有一條特異性條帶，說(shuō)明蛋白純度較高。免疫小鼠檢測(cè)小鼠血清抗體效價(jià)，其中150μg/只/次小鼠血清抗重組RVG蛋白的抗體效價(jià)為1∶25600，說(shuō)明重組RVG蛋白具有較好的免疫原性。間接免疫熒光結(jié)果顯示重組RVG免疫小鼠產(chǎn)

9、生的抗體能與狂犬病病毒Flury株特異性結(jié)合。③重組RVG蛋白免疫轉(zhuǎn)人IgM基因小鼠，取免疫后的小鼠脾細(xì)胞與SP2/0細(xì)胞融合，挑選陽(yáng)性雜交瘤細(xì)胞株經(jīng)過(guò)三次亞克隆后共獲得5株穩(wěn)定分泌全人源抗重組RVG蛋白單抗的雜交瘤細(xì)胞株，分別命名為5D1、9A3、15D6、19E6、6H11。④雙抗體夾心ELISA結(jié)果顯示5株單抗均為人源性免疫球蛋白IgM類型的抗體。間接ELISA實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明5株單抗均能特異性結(jié)合重組RVG蛋白，3株6H11、15D

10、6、9A3可以與滅活狂犬病病毒CVS-11株特異性結(jié)合。
　　結(jié)論：⑴構(gòu)建了重組表達(dá)載體rBacmid-RVG，成功用Bac-To-Bac桿狀病毒昆蟲(chóng)細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)并純化了重組RVG蛋白，該重組蛋白具有較好的免疫原性，為制備全人源抗狂犬病病毒糖蛋白抗體提供了有效抗原。⑵建立了5株穩(wěn)定分泌全人源抗重組RVG蛋白IgM單抗的雜交瘤細(xì)胞株，5株單抗均能特異性識(shí)別重組RVG蛋白，其中3株能與滅活狂犬病病毒CVS-11株特異性結(jié)合。為一步