抗狂犬病病毒N蛋白單克隆抗體的制備及免疫學(xué)檢測方法的建立.pdf

1、狂犬病(Rabies)是由狂犬病病毒(Rabies virus,RV)引起的一種人獸共患傳染病,一旦發(fā)病,死亡率幾乎為100％?？袢〕嗜蛐苑植?每年大概有5.5萬人死于該疾病。盡管在控制狂犬病方面做了很多努力,但在發(fā)展中國家,犬貓患病仍然是一個極為嚴(yán)重的問題。對犬貓接種狂犬疫苗后免疫效果的評價以及對狂犬病病原的診斷是防止和控制狂犬病的關(guān)鍵。鑒于以上現(xiàn)實考慮,本研究利用基因工程技術(shù)以及免疫學(xué)技術(shù)建立了狂犬病病毒抗體和抗原的檢測方法,為

2、狂犬病的防制工作的開展奠定了基礎(chǔ)。
　　 用RT-PCR方法分別擴(kuò)增山狂犬病病毒Flury LEP株N基因及其N1區(qū)域(1000-1353 bp),將二者分別克隆至原核表達(dá)載體pGEX-6P-1中,并將重組的表達(dá)載體分別轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21(DE3)中,經(jīng)1mmol／L IPTG誘導(dǎo)后進(jìn)行免疫印跡分析。結(jié)果表明,重組的RV-N和RV-N1均以包涵體形式表達(dá)。與表達(dá)全長RV-N相比,RV-N1的表達(dá)量顯著高于前者,且該重組蛋白同

3、樣具有良好的反應(yīng)原性。用純化的重組RV-N1作為診斷抗原建立了檢測犬RV抗體的SPA-ELISA方法。通過優(yōu)化反應(yīng)條件,確定抗原最佳包被量是2μg／mL,血清的最佳稀釋度為1:100,ProteinA-HRP的稀釋度為1:4000。用建立的ELISA方法對102份臨床血清樣品進(jìn)行檢測,與商品化試劑盒相比,二者的符合率為94.1％。試驗結(jié)果表明基于主要抗原表位所在區(qū)域N1蛋白的SPA-ELISA方法可有效用于犬RV抗體水平的檢測,為檢測R

4、V免疫抗體的ELISA試劑盒的研制奠定了基礎(chǔ)。
　　 將純化后的pET-32a-RV-N蛋白免疫BALB／c小鼠,取小鼠脾臟細(xì)胞和SP2／0細(xì)胞融合后,用pGEX-6P-1-RV-N重組蛋白作為篩選抗原,經(jīng)三次亞克隆篩選后得到1D9、286、3C5、685及5F2五株單克隆抗體細(xì)胞株。亞類鑒定結(jié)果表明,其中1D9、286、685三株亞類為IgG1型,3C5、5F2的亞類為IgM型。間接ELISA方法檢測286單抗細(xì)胞腹水效價可達(dá)

5、1:106。經(jīng)Protein G親和層析柱純化和脫鹽后可得到濃度為2.5 mg／mL的高純度的單克隆抗體。免疫熒光試驗結(jié)果表明五株單克隆抗體均能特異地與狂犬病病毒結(jié)合。
　　 用純化后的pET-32a-RV-N蛋白免疫新西蘭白兔,將收集的兔高免血清用Protein A親和層析柱純化后得到高純度的抗狂犬病病毒N蛋白的多克隆抗體。間接ELISA測定多抗的效價可達(dá)1:2×105。用生物素標(biāo)記多抗后,建立了一種“抗RV-N蛋白單抗—病原