偽狂犬病病毒gE基因主要抗原表位區(qū)的原核表達及間接ELISA檢測方法的初步建立.pdf

1、本研究以豬偽狂犬病病毒(PRV)四川分離SL株為材料，分子克隆gE基因全序列并進行生物信息學分析，選擇gE基因主要抗原表位區(qū)片段進行原核表達載體構(gòu)建、原核表達及間接ELISA檢測方法的初步建立。
　　 1.gE基因的分子克隆與生物信息學分析
　　 參照GenBank中登錄號為NC006151的gE基因序列，以四川分離的PRVSL株為材料，TA克隆到pMD19T-SimpleVector，構(gòu)建重組克隆質(zhì)粒pMD-gE，經(jīng)酶

2、切鑒定和序列測定，克隆出長為1964bp的基因片段，其中包含1734bp的gE基因完整閱讀框，編碼578個氨基酸。將測序結(jié)果及推導的氨基酸序列與國內(nèi)外不同來源的10個毒株進行生物學信息分析，核苷酸序列同源性在97.5％～100.0％之間，氨基酸同源性在94.8％～99.8％之間，不同PRV毒株間gE基因在核苷酸水平和氨基酸水平上是高度保守的。分析得知，gE基因密碼子中G、C出現(xiàn)頻率較高，分別占了40％和30％，出現(xiàn)頻率最高的四個密碼子為

3、GGG、GAC、CTG和CGC，且GC3s含量達96.89％，證明該基因?qū)τ贕、C具有明顯的偏愛性；二級結(jié)構(gòu)分析，主要以轉(zhuǎn)角和無規(guī)卷曲為主；通過疏水性分析和跨膜區(qū)預測，gE蛋白包含兩個疏水區(qū)，第一個疏水區(qū)（3～25位氨基酸殘基處）為信號肽，第二個疏水區(qū)（429～452位氨基酸殘基處）跨膜一次，N端位于膜外側(cè)，C端位于膜內(nèi)側(cè)；抗原位點預測分析，gE基因的抗原表位大部分位于N端300個氨基酸內(nèi)。
　　 2.gE基因主要抗原表位區(qū)原核

4、表達載體構(gòu)建及活性檢測
　　 以pMD-gE重組質(zhì)粒為模板，設計一對引物，PCR擴增出gE基因主要抗原表位區(qū)(mgE)（包含52-263氨基酸殘基片段），TA克隆到pMD19T-SimpleVector載體上，構(gòu)建克隆重組質(zhì)粒pMD-mgE，將陽性克隆菌送公司測序，測序結(jié)果與模板中對應序列完全一致。用EcoRⅠ和SalⅠ限制性內(nèi)切酶定向克隆到pET-32a(+)載體中，構(gòu)建重組原核表達質(zhì)粒pET-mgE，然后轉(zhuǎn)化高效表達菌E.c

5、oliRosettaTM(DE3)進行表達研究。經(jīng)IPTG誘導，SDS-PAGE電泳檢測顯示，在約42Ku處出現(xiàn)一條特異帶，Western-Blot檢測顯示表達的融合目的蛋白具有特異的反應原性。
　　 3.gE基因表達蛋白的純化及其ELISA檢測方法的初步建立
　　 對誘導表達后以包涵體形式存在的mgE重組蛋白進行純化，作為包被抗原，并對抗原的包被，作用時間及底物選擇等條件進行優(yōu)化，最后通過特異性試驗、重復性試驗、阻斷試

6、驗以及和與標準試劑盒對比等方法檢驗已建立的ELISA方法效果，初步建立了豬偽狂犬病病毒抗體的gE-ELISA檢測方法。結(jié)果表明，ELISA最佳工作條件為：重組抗原最適包被質(zhì)量濃度為8.3ug/mL，最適包被條件為4℃過夜，血清稀釋度為1:40，血清和酶標二抗的反應時間分別為37℃下90min和60min，反應底物用TMB溶液，37℃顯色10min；統(tǒng)計學分析后確定陰陽性的臨界值為0.32。各項檢測試驗的結(jié)果表明此方法特異性強、重復性好、