豬偽狂犬病毒gE基因亞克隆、原核表達(dá)及ELISA抗體檢測(cè)方法的建立.pdf

1、豬偽狂犬病(porcine Pseudorabies，PR)是由豬皰疹病毒Ⅰ型(pseudorabiesvirus，PRV)引起豬的一種急性傳染病。該病已在世界范圍內(nèi)廣泛流行，給養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。結(jié)合相應(yīng)的鑒別診斷方法，并采取相應(yīng)的控制措施是預(yù)防該病的有效手段。gE糖蛋白是其主要的毒力因子之一，gE基因的缺失可以使PRV毒力大大降低，但不影響其免疫原性。目前gE基因缺失弱毒株已經(jīng)在世界各國(guó)廣泛使用。由于缺失疫苗與野毒株之間在g

2、E基因上的差別，因此，gE基因可以區(qū)分疫苗免疫和野毒感染。本研究克隆表達(dá)了gE的主要抗原表位區(qū)，并將其作為包被抗原，建立了快速檢測(cè)豬偽狂犬病的血清學(xué)診斷方法。
　　根據(jù)GenBank中已發(fā)表的豬偽狂犬病毒gE全基因序列，設(shè)計(jì)合成一對(duì)特異性引物，采用PCR技術(shù)擴(kuò)增gE全基因，克隆后進(jìn)行序列測(cè)定，測(cè)序正確的質(zhì)粒命名為PRV-gE。根據(jù)gE糖蛋白及原核表達(dá)載體pET32a的特點(diǎn)，選取一段抗原性較高的序列用Primer5.0軟件設(shè)計(jì)另一對(duì)

3、特異性引物。從重組質(zhì)粒PRV-gE中擴(kuò)增gE基因抗原性較高的序列(gE')，將其與原核表達(dá)載體pET32a連接，構(gòu)建表達(dá)質(zhì)粒pET32a-gE'。經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后SDS-PAGE電泳可檢測(cè)到分子質(zhì)量約為45 ku的蛋白，與預(yù)期的蛋白分子量大小基本一致，以可溶性形式存在于上清中。利用原核表達(dá)載體pET32a上帶有的His標(biāo)簽對(duì)pET32a-gE'重組蛋白進(jìn)行純化，純化蛋白的Western-blotting結(jié)果顯示，該重組蛋白與PRV陽(yáng)性血

4、清具有良好的反應(yīng)原性。表明分子質(zhì)量約45 ku的蛋白即為目的蛋白。
　　以純化的重組蛋白作為包被抗原，通過(guò)系列反應(yīng)條件的優(yōu)化，建立了檢測(cè)PRV抗體的間接ELISA檢測(cè)方法。優(yōu)化結(jié)果顯示，該方法的抗原最佳包被濃度為6.0μg/mL;封閉液為含5％犢牛血清的PBST工作液;陰陽(yáng)性血清最佳稀釋度為1∶40，37℃作用1 h;酶標(biāo)抗體最佳稀釋度為1∶200，37℃作用1 h;底物顯色時(shí)間為15min。與IDEXX公司PRV ELISA試劑