豬偽狂犬病毒結(jié)構(gòu)蛋白gB和gD主要抗原區(qū)的原核表達(dá)以及豬血清PRV gB抗體間接ELISA檢測方法的建立.pdf

1、偽狂犬病毒(Pseudorabiesvirus，PRV)是皰疹病毒科(Herpesviridae)a皰疹病毒亞科的成員，可引起豬、牛、羊及野生動(dòng)物的偽狂犬病，豬是其主要宿主，偽狂犬病給養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。為了加強(qiáng)對(duì)該病的疫情監(jiān)測和流行病學(xué)調(diào)查，有必要研究開發(fā)出一種特異性強(qiáng)、敏感性高的血清學(xué)檢測試劑。PRV的結(jié)構(gòu)蛋白gB和gD非常保守且具有良好的免疫原性，可作為理想的血清學(xué)檢測用抗原。
　　 本研究利用大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)

2、了偽狂犬病毒gB和gD蛋白主要抗原表位區(qū)，獲得了純化的重組蛋白，用純化的gB重組蛋白建立了gB-ELISA診斷方法，用于檢測豬血清中PRV gB抗體。主要研究內(nèi)容如下：
　　 ㈠豬偽狂犬病毒結(jié)構(gòu)蛋白gB和gD主要抗原區(qū)的原核表達(dá)。
　　 參照GenGank發(fā)表的PRV中國株基因序列，分別針對(duì)gB和gD基因設(shè)計(jì)引物，通過PCR方法擴(kuò)增出包含gB和gD主要抗原表位區(qū)600bp和677bp的基因片段，克隆到pGEM-T-Vec

3、tor上，再分別插入到原核表達(dá)載體pET-32(a)的T7啟動(dòng)子下游，建立pET-gB和pET-gD兩個(gè)重組表達(dá)載體，將載體分別轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21(DE3)中誘導(dǎo)表達(dá)，表達(dá)產(chǎn)物分子量大小分別為42.4KDa和45.2KDa。經(jīng)BandScan分析，表達(dá)量分別占菌體蛋白的60.5％和52.3％。Western-blot分析結(jié)果表明，表達(dá)的兩個(gè)重組蛋白均能與PRV豬陽性血清發(fā)生特異性反應(yīng)。表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)His·Bind親和層析法純化后，獲得

4、的重組蛋白gB和gD的濃度達(dá)到1mg/ml和0.98mg/ml。
　　 ㈡豬偽狂犬病毒血清抗體間接gB-ELISA檢測方法的初步建立。
　　 以在大腸桿菌中高效表達(dá)的偽狂犬病毒gB重組蛋白作為抗原，包被聚乙烯反應(yīng)板，以辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的兔抗豬IgG為二抗，初步建立了針對(duì)血清gB抗體的間接gB-ELISA。對(duì)ELISA各種反應(yīng)條件進(jìn)行優(yōu)化，確定了最適工作條件。研究表明，重組抗原最適包被濃度為315ng/孔，4℃

5、包被過夜，待檢血清最適稀釋度為1∶40。待檢血清和酶標(biāo)記二抗的反應(yīng)溫度和時(shí)間均為37℃，30min；底物37℃顯色10min，讀取OD450值。血清樣品OD450≥0.1×ODp+0.9×ODN判為陽性。運(yùn)用本方法檢測豬血清樣品時(shí)，與陰性血清反應(yīng)的本底值極低，與強(qiáng)陽性血清反應(yīng)的OD450高達(dá)2.0以上。用建立的間接gB-ELISA分別檢測豬圓環(huán)病毒病、細(xì)小病毒感染、豬瘟、豬日本腦炎和豬繁殖與呼吸綜合征陽性血清，結(jié)果均為陰性，說明該方法具