偽狂犬病毒gE基因主要抗原區(qū)的表達及其表達蛋白間接ELISA診斷方法的研究.pdf

1、(偽狂犬病Pseudorabies，PR)是由α皰疹病毒科的偽狂犬病病毒(PseudorabiesVirus，PrV)引起的包括多種家畜和野生動物共患的一種急性傳染病。豬是本病毒的天然宿主和貯存者，該病給養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟損失。預(yù)防、控制并最終根除該病是我國當前面臨的一項艱巨任務(wù)。在歐美等發(fā)達國家的偽狂犬病根除計劃中，多采用gE缺失標記疫苗和相應(yīng)的gE抗體鑒別診斷方法。同時gE糖蛋白也是PrV的一種十分重要的糖蛋白，在決定病毒的毒力

2、及神經(jīng)嗜性等方面起著重要作用，但gE不是PrV增殖所必需的蛋白，因此可作為缺失的候選基因。目前我國已研制成功gE基因標記疫苗。為了建立適合我國國情的gE鑒別診斷方法，開展了以下研究。 1.PrVgE基因的主要抗原表位區(qū)在大腸桿菌中的表達 將偽狂犬病病毒(PrV)MinA株gE基因主要抗原表位區(qū)0.63kb的片段融合到原核表達載體pET-28a的T7啟動子下游，構(gòu)建成原核表達質(zhì)粒，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)，SDS-PAGE和West

3、ern-blot印跡分析，證實gE基因主要抗原表位區(qū)在大腸桿菌中獲得了表達，表達產(chǎn)物具有抗原性，分子量為29kD，位于包涵體中。 2.表達蛋白的純化與復(fù)性 MinA株gE基因主要抗原區(qū)在pET-28a表達載體中表達產(chǎn)量較高，但是都以包涵體形式存在，必須經(jīng)過復(fù)性才具有生物學(xué)活性。收集誘導(dǎo)表達的菌液，超聲波破碎分離包涵體，尿素和TritonX-100分別洗滌包涵體，用尿素溶解包涵體，復(fù)性液稀釋變性蛋白，緩沖液透析獲取純化蛋白

4、。SDS-PAGE分析電泳結(jié)果表明，尿素和TritonX-100可洗去部分雜蛋白，8mol/L尿素能很好的溶解包涵體，回收率約20％，其純度可達85％左右。ELISA試驗測定的結(jié)果顯示，與復(fù)性前變性蛋白相比，純化蛋白與PrV陽性血清反應(yīng)的特異性有明顯提高。 3.gE-ELISA的建立 將經(jīng)純化、變性、復(fù)性等處理后的gE蛋白作為抗原，以辣根過氧化物酶(HRP)標記的兔抗豬IgG為二抗，建立了檢測偽狂犬病毒抗體的間接ELIS

5、A方法，并確定了ELISA最佳工作條件：抗原最佳包被濃度為14.5ug/ml，最佳包被時間為37℃1h，再4℃過夜；偽狂犬陽性血清(1∶80)在37℃作用1h；二抗(1∶3000)37℃作用1h。通過重復(fù)性試驗、交叉試驗、特異性試驗和穩(wěn)定性試驗等試驗結(jié)果表明該方法重復(fù)性好、特異性強、靈敏度高。以該方法檢測100份己知背景豬血清，結(jié)果表明，該方法診斷特異性為94％，診斷敏感性為96％。以3塊不同批次包被抗原的酶標板檢測10份血清，結(jié)果顯示