番木瓜環(huán)斑病毒CI互作寄主因子的篩選與分析.pdf

1、番木瓜環(huán)斑病毒病(Papaya Ringspot Virus,PRSV)一直是威脅番木瓜種植業(yè)發(fā)展最嚴(yán)重的病害之一。柱狀內(nèi)含體蛋白(Cylindrical inclusion protein,CI)做為PRSV重要的功能蛋白之一,具有RNA解旋酶的活性,并參與病毒粒子在細(xì)胞中的運(yùn)動(dòng)、病毒粒子的復(fù)制和病毒侵染癥狀的產(chǎn)生等多個(gè)過(guò)程。CI的多功能性預(yù)示著它與寄主植物編碼基因間的相互作用在病毒致病與植物防御過(guò)程中起重要作用。本研究是在前期成功構(gòu)

2、建PRSV誘導(dǎo)的番木瓜cDNA文庫(kù)的基礎(chǔ)上,應(yīng)用不依賴(lài)轉(zhuǎn)錄激活機(jī)制的胞質(zhì)酵母雙雜交系統(tǒng)-Sos恢復(fù)系統(tǒng)(Sos recruitment system,SRS)來(lái)尋找與PRSV的CI蛋白互作的寄主蛋白因子,在此基礎(chǔ)上探求PRSV與寄主相互作用的機(jī)制。
　　 本實(shí)驗(yàn)以PRSV海南分離物總RNA為模板,克隆出CI基因,并成功構(gòu)建了可應(yīng)用與Sos恢復(fù)系統(tǒng)的誘餌載體pSOS-CI。應(yīng)用醋酸鋰法將誘餌質(zhì)粒pSOS-CI轉(zhuǎn)化溫敏突變型酵母細(xì)胞

3、cdc25H(α)。通過(guò)營(yíng)養(yǎng)缺陷和溫度敏感篩選,驗(yàn)證了CI可以在cdc25H(α)中表達(dá),但不具有自激活作用,因而可作為誘餌蛋白篩選與其相互作用的蛋白。經(jīng)過(guò)Sos恢復(fù)系統(tǒng)初步篩選,共獲得2個(gè)候選的互作寄主蛋白,同源比對(duì)分析結(jié)果表明:其中一個(gè)蛋白與葉綠體延伸因子Tu(Elongation factor Tu,EF-Tu)的氨基酸序列具有較高同源性;而另一個(gè)為未知蛋白。再將候選寄主蛋白EF-Tu基因的文庫(kù)質(zhì)粒和誘餌質(zhì)粒進(jìn)行回轉(zhuǎn)和自激活驗(yàn)證,

4、結(jié)果可以判定候選番木瓜蛋白EF-Tu在酵母細(xì)胞中可以與PRSV誘餌蛋白CI相互作用。
　　 通過(guò)運(yùn)用生物信息學(xué)技術(shù)并結(jié)合PCR等基因工程技術(shù)獲得了EF-Tu的全長(zhǎng)序列。分析顯示,各不同物種間EF-Tu的相似性較高,其蛋白質(zhì)同源相似率在70％左右。其序列3'端較保守,5'端差異性較大。
　　 本研究初步獲得了PRSV的CI蛋白互作寄主蛋白EF-Tu。為進(jìn)一步闡明PRSV-番木瓜寄主互作機(jī)制提供了新的線(xiàn)索。CI-EF-Tu的