番木瓜環(huán)斑病毒(PRSV)ci和nib反向重復(fù)結(jié)構(gòu)表達(dá)載體的轉(zhuǎn)化研究.pdf

1、番木瓜環(huán)斑病毒病是番木瓜的第一大病毒性病害，在世界范圍內(nèi)造成較大危害，目前還沒(méi)有十分有效的化學(xué)藥劑能控制PRSV病害，只能采取以栽培措施為主的綜合防治措施。植物基因工程的快速發(fā)展為植物抗病提供了一條嶄新而有效的方法，尤其是近年來(lái)RNAi領(lǐng)域研究的快速發(fā)展，利用反向重復(fù)表達(dá)載體對(duì)植物進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化成為研究植物抗病毒研究的一大熱點(diǎn)。
　　 本研究以番木瓜胚狀體、黃瓜子葉節(jié)作為轉(zhuǎn)化材料，利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將反向重復(fù)表達(dá)載體pHellsga

2、te-CIIR、pHellsgate-NIbIR導(dǎo)入到受體材料中，期望得到轉(zhuǎn)基因植株。同時(shí)利用原生質(zhì)體瞬時(shí)表達(dá)體系初步研究了反向重復(fù)表達(dá)載體對(duì)目標(biāo)基因的沉默效果。主要研究結(jié)果如下：
　　 (1)對(duì)番木瓜下胚軸、葉柄、幼胚以及番木瓜愈傷組織進(jìn)行胚狀體誘導(dǎo)，僅從幼胚和愈傷組織上得到了番木瓜胚狀體，其中以幼胚誘導(dǎo)產(chǎn)生的胚狀體數(shù)量多，耗時(shí)短，40d左右即能從幼胚中誘導(dǎo)出胚狀體，誘導(dǎo)率為20％。
　　 (2)以黃瓜子葉節(jié)為外植體建

3、立了黃瓜再生體系，使用含有表達(dá)載體pHellsgate-CIIR、pHellsgate-NibIR的農(nóng)桿菌侵染黃瓜子葉節(jié)，通過(guò)抗生素篩選，得到了黃瓜轉(zhuǎn)化苗。
　　 (3)用PRSV病毒粒子與反向重復(fù)表達(dá)載體pHellsgate-CIIR共轉(zhuǎn)化番木瓜原生質(zhì)體，12、24、36、48h分別取樣，經(jīng)原生質(zhì)體總RNA提取、RT-PCR檢測(cè)，結(jié)果顯示，對(duì)于只轉(zhuǎn)化PRSV的原生質(zhì)體，24h開(kāi)始能夠檢測(cè)到病毒ci基因的表達(dá)，且隨著時(shí)間延長(zhǎng)，c