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1、番木瓜環(huán)斑病毒病是番木瓜的第一大病毒性病害,在世界范圍內(nèi)造成較大危害,目前還沒(méi)有十分有效的化學(xué)藥劑能控制PRSV病害,只能采取以栽培措施為主的綜合防治措施。植物基因工程的快速發(fā)展為植物抗病提供了一條嶄新而有效的方法,尤其是近年來(lái)RNAi領(lǐng)域研究的快速發(fā)展,利用反向重復(fù)表達(dá)載體對(duì)植物進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化成為研究植物抗病毒研究的一大熱點(diǎn)。
本研究以番木瓜胚狀體、黃瓜子葉節(jié)作為轉(zhuǎn)化材料,利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將反向重復(fù)表達(dá)載體pHellsga
2、te-CIIR、pHellsgate-NIbIR導(dǎo)入到受體材料中,期望得到轉(zhuǎn)基因植株。同時(shí)利用原生質(zhì)體瞬時(shí)表達(dá)體系初步研究了反向重復(fù)表達(dá)載體對(duì)目標(biāo)基因的沉默效果。主要研究結(jié)果如下:
(1)對(duì)番木瓜下胚軸、葉柄、幼胚以及番木瓜愈傷組織進(jìn)行胚狀體誘導(dǎo),僅從幼胚和愈傷組織上得到了番木瓜胚狀體,其中以幼胚誘導(dǎo)產(chǎn)生的胚狀體數(shù)量多,耗時(shí)短,40d左右即能從幼胚中誘導(dǎo)出胚狀體,誘導(dǎo)率為20%。
(2)以黃瓜子葉節(jié)為外植體建
3、立了黃瓜再生體系,使用含有表達(dá)載體pHellsgate-CIIR、pHellsgate-NibIR的農(nóng)桿菌侵染黃瓜子葉節(jié),通過(guò)抗生素篩選,得到了黃瓜轉(zhuǎn)化苗。
(3)用PRSV病毒粒子與反向重復(fù)表達(dá)載體pHellsgate-CIIR共轉(zhuǎn)化番木瓜原生質(zhì)體,12、24、36、48h分別取樣,經(jīng)原生質(zhì)體總RNA提取、RT-PCR檢測(cè),結(jié)果顯示,對(duì)于只轉(zhuǎn)化PRSV的原生質(zhì)體,24h開(kāi)始能夠檢測(cè)到病毒ci基因的表達(dá),且隨著時(shí)間延長(zhǎng),c
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