C3基因多態(tài)性及其與中國(guó)荷斯坦牛生產(chǎn)性狀的相關(guān)性分析.pdf

1、疾病是影響家畜生產(chǎn)的主要因素，在發(fā)達(dá)國(guó)家，由疾病造成的損失占家畜生產(chǎn)總成本的17％左右，而在發(fā)展中國(guó)家，損失則高達(dá)35～50％。多種病原菌感染引發(fā)的奶牛乳腺炎，是奶牛常見的多發(fā)性疾病，給世界各國(guó)奶牛業(yè)造成巨大經(jīng)濟(jì)損失。目前已有多種方法來防控奶牛乳腺炎，雖然也取得了一定的臨床效果，但卻引發(fā)了耐藥菌株和抗生素殘留等公共衛(wèi)生問題。因而，應(yīng)用現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)分析抗性和易感群體中候選基因的標(biāo)記等位基因頻率差異，結(jié)合遺傳育種技術(shù)，從根本上提高家畜

2、的抗病性與健康水平已成為當(dāng)今家畜抗病育種研究的熱點(diǎn)。
　　補(bǔ)體(Complement)作為存在于人或脊索動(dòng)物血清和組織液中的一組不耐熱的經(jīng)過活化后具有酶活性的球蛋白，其作用主要表現(xiàn)在溶解細(xì)菌和病毒、殺傷腫瘤細(xì)胞及感染病毒的細(xì)胞、免疫粘附和調(diào)理吞噬以及作為炎癥介質(zhì)上。補(bǔ)體成分3(C3)位于補(bǔ)體經(jīng)典途徑、甘露糖結(jié)合凝集素途徑和補(bǔ)體旁路途徑三條激活途徑的匯合點(diǎn)，是補(bǔ)體系統(tǒng)最重要的分子；而且C3裂解片段及其結(jié)合蛋白復(fù)雜多樣，不僅可以通過自

3、身的激活、裂解，參與補(bǔ)體的級(jí)聯(lián)反應(yīng)，還可以與各種相關(guān)因子發(fā)生相互作用，完成對(duì)病原菌的免疫粘附和吞噬作用，對(duì)補(bǔ)體系統(tǒng)進(jìn)行調(diào)節(jié)。因而，C3在免疫防御、免疫調(diào)控以及免疫病理中發(fā)揮著重要的作用。當(dāng)C3基因發(fā)生突變或缺失時(shí)會(huì)造成C3缺陷性疾病，常伴發(fā)免疫性疾病及反復(fù)細(xì)菌感染，患者對(duì)病原菌感染的易感性顯著增加。運(yùn)用蛋白電泳分型技術(shù)和PCR限制性酶切片段多態(tài)性(PCR-RFLP)、PCR單鏈構(gòu)象多態(tài)性(PCR-SSCP)及DNA測(cè)序技術(shù)分析人、豬、小

4、鼠及羊等哺乳動(dòng)物中的C3基因，發(fā)現(xiàn)其存在多態(tài)性，眾多研究表明C3多態(tài)性與某些補(bǔ)體缺失性疾病、炎癥反應(yīng)及精神性障礙疾病均有著重要的關(guān)聯(lián)性。
　　中國(guó)荷斯坦奶牛是由引進(jìn)的純種Holstein公牛與本地母牛的高代雜交種，經(jīng)長(zhǎng)期選育而成，產(chǎn)奶量較高，但乳腺炎發(fā)病率也高達(dá)38％～50％。而魯西黃牛和渤海黑牛是山東省特有的、最具代表性的中國(guó)肉牛八大品種之一，耐粗飼、乳腺炎發(fā)病率較低。本試驗(yàn)試圖比較三個(gè)牛群中C3基因單核苷酸多態(tài)性(SNP)差異

5、，分析其與中國(guó)荷斯坦奶牛產(chǎn)奶性狀的關(guān)聯(lián)性，進(jìn)而通過血清中C3濃度測(cè)定、補(bǔ)體活性測(cè)定、抗菌試驗(yàn)等一系列試驗(yàn)，驗(yàn)證相關(guān)性分析結(jié)果，初步闡明其抗性機(jī)理。
　　本文掃描了中國(guó)荷斯坦牛、魯西黃牛、渤海黑牛的C3基因前33個(gè)外顯子區(qū)及5’側(cè)翼區(qū)片段，發(fā)現(xiàn)了3個(gè)新的SNP位點(diǎn)，進(jìn)一步分析了此三個(gè)位點(diǎn)在三個(gè)中國(guó)牛群中的多態(tài)性及其與中國(guó)荷斯坦奶牛產(chǎn)奶性狀的相關(guān)性，在此基礎(chǔ)上，進(jìn)一步研究了其與354頭中國(guó)荷斯坦奶牛的補(bǔ)體活性(CH50，ACH50)、

6、C3濃度關(guān)聯(lián)性，并通過對(duì)乳牛乳腺炎主要致病菌金葡菌和大腸桿菌的抑菌實(shí)驗(yàn)來驗(yàn)證我們的關(guān)聯(lián)性分析結(jié)果。相關(guān)實(shí)驗(yàn)結(jié)果如下:
　　采用巢式PCR和DNA測(cè)序方法，發(fā)現(xiàn)了三個(gè)新的SNP位點(diǎn)(g。-1293C>G，g。56T>C，g。7017C>T)，已經(jīng)提交至 NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中，SNPs登錄號(hào)分別為ss289377982，ss289377985，ss289377986。SNP(g。-1293C>G)位于5’側(cè)翼區(qū)，推測(cè)該區(qū)域及鄰近區(qū)域可能對(duì)

7、C3蛋白的表達(dá)調(diào)控和信號(hào)肽的表達(dá)起決定性的作用；SNP(g。56T>C)位于外顯子1上，導(dǎo)致編碼信號(hào)肽的第19個(gè)氨基酸從甲硫氨酸突變成蘇氨酸；SNPs(g。7017C>T)位于外顯子12上，為無義突變，CAC(His)>CAT(His)，仍編碼C3蛋白beta鏈的第455位的組氨酸。
　　通過CRS-PCR和PCR-RFLP(Restriction Fragment Length Polymorphism-PCR)方法，發(fā)現(xiàn)3個(gè)S

8、NP位點(diǎn)(g。-1293C>G，g。56T>C，g。7017C>T)在中國(guó)荷斯坦牛、魯西黃牛、渤海黑牛群體的優(yōu)勢(shì)等位基因相同，均為:C，T，C；其頻率分別是83.5％/88。21％/76％，70.62％/85.75％/82％，82.89％/80.19％/80％。經(jīng)χ2適合性檢驗(yàn)，除 g。-1293C>G位點(diǎn)在魯西黃牛中沒有達(dá)到 Hardy-Weinberg平衡狀態(tài)(P＜0.05)外，三個(gè)位點(diǎn)g。-1293C>G，g。56T>C，g。70

9、17C>T在三個(gè)牛群中均達(dá)到Hardy-Weinberg平衡狀態(tài)(P＞0.05)。中國(guó)荷斯坦牛和魯西黃牛在g。-1293C>G位點(diǎn)，魯西黃牛在g。56T>C位點(diǎn)、中國(guó)荷斯坦牛在g。7017C>T位點(diǎn)都表現(xiàn)為低度多態(tài)(PIC<0.25)；其余則均表現(xiàn)為中度多態(tài)(0.25　　對(duì)具有3個(gè)泌乳記錄的821頭中國(guó)荷斯坦牛C3基因與體細(xì)胞數(shù)和產(chǎn)奶性狀進(jìn)行了相關(guān)性分析，在試驗(yàn)群體中三個(gè)位點(diǎn)共構(gòu)建出8種單倍型，發(fā)現(xiàn)19種單倍

10、型組合。關(guān)聯(lián)性分析發(fā)現(xiàn)g。-1293C>G與乳蛋白含量存在顯著相關(guān)性(P＜0.05)，而位點(diǎn)g。56T>C與SCS具顯著相關(guān)性(P＜0.05)。在單倍型組合中，H1H1(CCC/CCC)的奶牛個(gè)體其乳脂率和乳蛋白率顯著要高于H1H8(CCC/GTT)的奶牛個(gè)體(P＜0.05)，而 H1H5(CCC/GCC)個(gè)體的SCS顯著低于H1H8(CCC/GTT)個(gè)體(P＜0.01)。以奶牛乳腺炎主要致病菌金黃色葡萄球菌和大腸桿菌作為試驗(yàn)對(duì)象，選擇

11、單倍型組合為H1H5的個(gè)體作為乳腺炎抗性個(gè)體組，選擇單倍型組合為H1H8的個(gè)體作為易感個(gè)體組，體外抑菌試驗(yàn)表明:易感組和抗性處理組的菌落數(shù)都顯著高于未處理的抗性組個(gè)體(P＜0.01)；也進(jìn)一步證實(shí)對(duì)乳腺炎的抗性與血清中的C3蛋白相關(guān)。因而，單倍型組合H1H1(CCC/CCC)和H1H5(CCC/GCC)可作為未來選擇抗乳腺炎和高乳蛋白奶牛的分子標(biāo)記。
　　首次大規(guī)模測(cè)定了有足夠血清的354頭中國(guó)荷斯坦奶牛的血清中C3蛋白濃度和補(bǔ)體

12、溶血活性，奶牛血清中C3濃度范圍是1.1-48。9mg/mL；CH50范圍是8.02-204.36 U/mL； ACH50范圍是11.67-95。12 U/mL。分析了C3基因單個(gè)SNPs位點(diǎn)及其單倍型組合與血清中C3蛋白濃度和補(bǔ)體溶血活性的相關(guān)性。發(fā)現(xiàn):位點(diǎn) g。56T>C與 SCS(P＜0.05)和ACH50(P＜0.01)值都具有顯著相關(guān)性，位點(diǎn)g。7017C>T與 ACH50值有極顯著相關(guān)性(P＜0.01)，上述結(jié)果表明 SNP

13、位點(diǎn)g。56T>C和g。7017C>T可作為補(bǔ)體活性性狀的分子標(biāo)記。單倍型組合為H2H4(CCT/CTT)的牛群比其他牛有更高的CH50值；H1H2(CCC/CCT)比H1H3(CCC/CTC)和H3H7(CTC/GTC)有顯著高的ACH50值(P＜0.01)。上述結(jié)果顯示牛C3基因單倍型組合H1H2(CCC/CCT)和H2H4(CCT/CTT)可作為未來補(bǔ)體活性性狀的分子標(biāo)記。但我們?cè)囼?yàn)結(jié)果僅是初步的，還需對(duì)C3基因5’側(cè)翼區(qū)和C3蛋