煙粉虱在健康和感毒煙草上的基因差異表達(dá)分析及蟲(chóng)體超氧化物歧化酶的初步研究.pdf

1、煙粉虱Bemisia tabaci廣泛分布于各大洲的多個(gè)國(guó)家和地區(qū),自20世紀(jì)80年代后期,具入侵性的煙粉虱Middle East-Asia Minor1(MEAM1)隱種(該隱種近年來(lái)通稱(chēng)為B型煙粉虱)開(kāi)始在多個(gè)國(guó)家和地區(qū)棉花、西葫蘆、甘藍(lán)等蔬菜及一品紅等作物上暴發(fā)成災(zāi),造成巨大損失。MEAM1隱種的入侵?jǐn)U張往往又伴隨著雙生病毒的蔓延成災(zāi)及新雙生病毒的出現(xiàn),煙粉虱-雙生病毒間的互惠共生很可能在雙生病毒的流行及煙粉虱的迅速擴(kuò)張中起了重要

2、作用。為深入了解煙粉虱與雙生病毒間互惠共生產(chǎn)生的機(jī)制以及這種關(guān)系在外來(lái)煙粉虱入侵中的作用,本研究以煙粉虱MEAM1隱種-中國(guó)番茄黃曲葉病毒(Tomatoyellow leafcurl China virus,TYLCCNV)-煙草為模式系統(tǒng),篩選MEAM1隱種在帶毒和健康煙草上取食后的差異表達(dá)基因,并結(jié)合分子生物學(xué)方法對(duì)相關(guān)基因展開(kāi)研究,嘗試從分子水平探討此模式系統(tǒng)中產(chǎn)生的互惠共生現(xiàn)象的內(nèi)在機(jī)制,為煙粉虱及其傳播的雙生病毒的防治提供理論

3、基礎(chǔ)。本研究的結(jié)果如下:
　　 (1)MEAM1隱種取食健康和帶毒煙草后蟲(chóng)體內(nèi)的差異表達(dá)基因
　　 以煙粉虱MEAM1隱種-TYLCCNV-煙草為模式系統(tǒng),采用抑制消減雜交(suppression subtractive hybridization,SSH)方法進(jìn)行雙向篩選,得到MEAM1隱種在TYLCCNV侵染煙草上取食后的124個(gè)上調(diào)的表達(dá)序列標(biāo)簽(ESTs)(正向文庫(kù),Forward library)及112個(gè)下調(diào)

4、ESTs(反向文庫(kù),Reverse library)。將正反向文庫(kù)中的ESTs和GenBank中的序列進(jìn)行同源性分析比對(duì),發(fā)現(xiàn)多個(gè)基因可能與雙生病毒-煙粉虱之間的直接互作相關(guān)。如正向文庫(kù)中的26／29 kDa蛋白水解酶、類(lèi)肝素硫酸蛋白聚糖(laeparan sulfate proteoglycan,HSPG)、煙粉虱次生共生菌立克次氏體及銅鋅超氧化物歧化酶(copper／zinc superoxide dismutase,CuZnSOD

5、)。結(jié)合先前的研究報(bào)道,推測(cè)26／29 kDa蛋白水解酶可能參與并協(xié)助清除煙粉虱體內(nèi)的病毒粒子；HSPG基因的上調(diào)也可能有助于TYLCCNV成功侵入煙粉虱細(xì)胞；次生共生菌立克次氏體相關(guān)基因的上調(diào)則可能與煙粉虱應(yīng)對(duì)TYLCCNV染產(chǎn)生的防御反應(yīng)相關(guān)。同時(shí),實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,煙粉虱取食帶毒煙草后,其體內(nèi)的CuZnSOD基因表達(dá)上調(diào),推測(cè)產(chǎn)生的機(jī)制可能是雙生病毒進(jìn)入MEAM1后,蟲(chóng)體內(nèi)的活性氧增加,激活了機(jī)體的抗氧化系統(tǒng)應(yīng)對(duì)病毒侵染。鑒于SOD在

6、生物體抗氧化脅迫中的重要作用,結(jié)合本研究的結(jié)果及實(shí)驗(yàn)室在煙粉虱抗氧化酶和雙生病毒侵染關(guān)系方面的前期工作基礎(chǔ),本課題的后續(xù)工作選擇了煙粉虱的CuZnSOD基因做進(jìn)一步研究。
　　 (2)煙粉虱CuZnSOD(Bt-CuZnSOD)的克隆、表達(dá)、純化及蟲(chóng)體酶活測(cè)定
　　 為從分子水平深入了解SOD在煙粉虱-雙生病毒及煙草互作中可能的積極作用,本實(shí)驗(yàn)克隆、表達(dá)并純化了MEAM1體內(nèi)的CuZnSOD,測(cè)定了純化后Bt-CuZnS

7、OD蛋白的酶活熱穩(wěn)定性,同時(shí)研究了在高低溫脅迫下MEAM1體內(nèi)Bt-CuZnSOD酶活的相應(yīng)變化情況。實(shí)驗(yàn)首先通過(guò)Rapid Amplification of cDNAEnds(RACE)技術(shù)獲得Bt-CuZnSOD的cDNA全長(zhǎng),并與其它多個(gè)物種的CuZnSOD比較后明確其具備典型的CuZnSOD特征:四個(gè)銅結(jié)合位點(diǎn),四個(gè)鋅結(jié)合位點(diǎn),兩個(gè)與二硫鍵形成相關(guān)的半胱氨酸及兩個(gè)銅鋅信號(hào)位點(diǎn)。利用各個(gè)物種CuZnSOD序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)表明B

8、t-CuZnSOD為胞內(nèi)CuZnSOD。同時(shí),使用GST融合蛋白表達(dá)系統(tǒng)成功對(duì)目的基因進(jìn)行原核表達(dá)與純化,最終得到純化的Bt-CuZnSOD蛋白并通過(guò)檢測(cè)證明了其活性。最后,實(shí)驗(yàn)設(shè)置了高低溫處理?xiàng)l件,并明確在高溫和低溫脅迫條件下蟲(chóng)體內(nèi)Bt-CuZnSOD的活性都顯著上升。推測(cè)入侵亞熱帶地區(qū)的MEAM1能在極端溫度下正常生存,可能與其體內(nèi)CuZnSOD能高效去除高溫環(huán)境下產(chǎn)生的過(guò)多氧自由基密切相關(guān)。
　　 本研究結(jié)果明確了TYLC

9、CNV可通過(guò)直接或間接方式對(duì)帶毒煙草上取食的煙粉虱體內(nèi)基因產(chǎn)生顯著影響,同時(shí)克隆并利用原核表達(dá)系統(tǒng)在體外成功表達(dá)了煙粉虱CuZnSOD基因,并獲得純化后具活性的Bt-CuZnSOD蛋白,且初步研究了其在逆境脅迫下的生理功能。推測(cè)在煙粉虱-雙生病毒-煙草三者互作過(guò)程中,MEAM1隱種基因表達(dá)譜的變化可能對(duì)煙粉虱的生殖力和存活率等生物學(xué)特征產(chǎn)生積極作用,從而產(chǎn)生互惠共生現(xiàn)象。本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果對(duì)于深入探討雙生病毒與煙粉虱間的互惠共生現(xiàn)象的分子機(jī)