超氧化物歧化酶sod的生產(chǎn)

1、項(xiàng)目二：超氧化物歧化酶（SOD）的生產(chǎn),,一. SOD的概況,1.超氧化物歧化酶（SOD）的概念： 超氧化物歧化酶是一種廣泛存在于動(dòng)物、植物、微生物中的金屬酶，是生物體內(nèi)抗氧化酶系中主要成員之一。,,2.SOD的分類 按其結(jié)合的金屬離子（即金屬輔基的成分）可分為：（1）Fe-SOD（2）Mn-SOD（是SOD酶分子內(nèi)所含金屬離子Mn2+）（3）Cu-Zn-SOD（銅．鋅超氧化物）,3.SOD的理化性質(zhì),3.1 SOD對氰

2、化物和H2O2的敏感性：長時(shí)間用過氧化氫處理可使CuZn-SOD和Fe-SOD失活，而Mn-SOD不受影響3.2 SOD的吸收光譜特性：CuZn-SOD具有獨(dú)特的紫外吸收光譜。由于色氨酸和酪氨酸的含量較低，它在280 nm處并沒有最大吸收峰。CuZn-SOD的可見光最大吸收波長都在680 nm左右， 這反映了酶分子中Cu2+的光學(xué)特性。,3.3 SOD穩(wěn)定性及影響因素：（1）PH、熱、蛋白酶的影響：SOD在pH5.3～9.6間催化性

3、能良好，在pH4.5～pH11間能穩(wěn)定存在。pH3.6時(shí)， CuZn-SOD中95%的Zn要脫落，在pH12.2時(shí)，SOD的構(gòu)象會發(fā)生不可逆的轉(zhuǎn)變而使酶失活。 （2）SOD對熱的穩(wěn)定性與溶液中離子強(qiáng)度有關(guān)。當(dāng)離子強(qiáng)度很低時(shí),即使加熱到95℃, 其活性損失也很少其他因素：SOD活性受飲料的色澤、成分、酸堿度、乙醇含量等多種因素的影響，只有在無色、近中性、無乙醇飲料中SOD活性較穩(wěn)定。另外還發(fā)現(xiàn)有機(jī)溶劑和Cl對SOD的活性具抑制作用。,4

4、.SOD的作用,它催化超氧陰離子轉(zhuǎn)化為H2O2和O2的反應(yīng)， 即催化超氧陰離子自由基O2-·發(fā)生歧化反應(yīng)， 從而清除O2-·，2O2-·+2H+→H2O2+O2， 在生命體的自我保護(hù)系統(tǒng)中起著極為重要的作用， 在免疫系統(tǒng)中也有重要的功，因而它能防御氧毒性，增強(qiáng)機(jī)體抗輻射損傷能力，防衰老。 SOD的主要功能是：清除體內(nèi)多余的自由基，延緩由于自由基侵害而出現(xiàn)的衰老現(xiàn)象，提高人體抵抗自由基誘發(fā)疾病的能力，能抗疲

5、勞、甚至抗腫瘤。,二 SOD的運(yùn)用,1.藥物SOD是一種新型的抗炎癥藥， 根據(jù)SOD作用機(jī)制和毒性試驗(yàn) ，它對治療因O2-·引起的各種 疾病都有一定的療效。為此， SOD可作為抗衰老、抗炎癥、自身免疫疾病患者廣泛應(yīng)用的醫(yī)藥品。此外，SOD對治療貝切特氏癥、心肌梗塞等血虛性心臟病、膠原病、新生兒呼吸困難綜合癥、防御放射性傷害等也可望有效。,2.添加劑 國外不少高級化妝品都添加SOD， 國內(nèi)也有數(shù)家工廠或公司在

6、開發(fā)和生產(chǎn)SOD化妝品， 如大寶SOD密，康妮SOD、SOD康舒達(dá)霜?jiǎng)┑?。SOD作為化妝品添加劑主要有3個(gè)優(yōu)點(diǎn)：（1）有明顯的防曬效果（2）可防皮膚衰老，阻止紫褐質(zhì)（老年斑）的形成（3）有明顯的抗炎效果，對防治皮膚病有一定效果。國外把SOD作為食品添加劑的例子是加在口香糖和飲料中。我國貴州農(nóng)學(xué)院已開發(fā)出刺梨SOD飲料。SOD及修飾過的SOD還可作為外用藥膏、眼藥及牙膏等的添加劑 。,3. 生化試劑國外已有數(shù)家公司如Sigma公

7、司等出售SOD試劑，國內(nèi)也有廠家批量生產(chǎn)SOD試劑， 如中科院上海生化所東風(fēng)試劑廠、南京建成生物工程研究所等。此外，SOD有可能作為某些疾病的探針， 如郭彥等人認(rèn)為腦瘤組織線粒體Mn-SOD降低是轉(zhuǎn)化細(xì)胞的可靠生化指標(biāo)之一， 并可作為評估腦瘤分化程度的參考。,,隨著人們對SOD更廣泛深入的研究，不同類型SOD、SOD修飾物及人工有機(jī)合成SOD模擬酶將在醫(yī)療、保健、食品、農(nóng)業(yè)增產(chǎn)等方面發(fā)揮出更大的作用。,三.SOD的生產(chǎn),儀器、試劑和材料

8、：-研缽，石英砂，燒杯（50mL），玻璃棒，pH計(jì)，冷凍離心機(jī)，離心管-新鮮蒜瓣-0.05mol/L磷酸緩沖溶液（pH7.8），氯仿-乙醇混合液（氯仿-無水乙醇3：5），丙酮（用前預(yù)冷至-10℃）。,提取SOD酶,,去除雜蛋白,,SOD酶的沉淀分離,,離心純化,,超濾濃縮,測定蛋白含量,,冷凍干燥后得成品,生產(chǎn)流程：,操作步驟：整個(gè)操作過程在0到5℃條件下進(jìn)行。,（1）SOD酶的提取 稱取5g大蒜蒜瓣，加入石英研磨破碎細(xì)胞后

9、，加入0.05mol/L的磷酸緩沖液（Ph7.8）15ml，繼續(xù)研磨20min，使SOD酶充分溶解到緩沖液中，然后6000r/min冷凍離心15min，棄沉淀，取上清液。,（2）去除雜蛋白 上清液中加入0.25倍體積的氯仿-乙醇混合液攪拌15min，6000r/min離心15min，棄去沉淀，得到的上清液即為粗酶液。（3）SOD酶的沉淀分離 粗酶液中加入等體積的冷丙酮，攪拌15min，6000/min離心15min，得到SOD酶沉

10、淀。,（4）將沉淀溶入pH7.8，0.05mol/L的磷酸緩沖液5mL中，然后6000r/min離心15min，放棄沉淀，取上清液，用凝膠sephacylS-200進(jìn)行純化，然后超濾濃縮。（5）用紫外分光光度計(jì)測定濃液的蛋白含量（6）將濃縮冷凍干燥后即得成品。,四、SOD酶的檢驗(yàn),原理： 連苯三酚在堿性條件下，能迅速自氧化，釋放出氧氣，生成帶色的中間產(chǎn)物。在自氧化過程的初始階段，黃色中間產(chǎn)物的積累在滯后30~45s后

11、就與時(shí)間成線性關(guān)系。中間產(chǎn)物在420nm處有強(qiáng)烈的光吸收，在有SOD存在時(shí)由于它能催化生成氧氣與過氧化氫，從而阻止了中間物的積累，通過計(jì)算就可以求出SOD的活力。,所需溶液的配制：,（1）pH值為8.30的50mol/LK2HPO4-KH2PO4緩沖溶液：25℃下96.5mL 1mol/L的LK2HPO4與3.5mL 1mol/L的KH2PO4混合后，用水稀釋至2000mL。（2）0.05mol/L連苯三酚溶液：稱取3.15g連苯三酚

12、用0.01mol/L鹽酸溶液溶解并定容至500mL。,2、酶活性的測定：（1）連苯三酚自氧化速率的測定在10ml試管中加入pH值為8.30的50mol/LK2HPO4-KH2PO4緩沖溶液4.50ml，在25±0.5℃的恒溫水浴中保溫10min，然后加入在25±0.5℃的恒溫水浴中事先預(yù)熱好的連苯三酚溶液（空白管用10mmol/L HCL代替），迅速搖勻倒入1cm比色皿中，以空白管為參比，在325nm下，每隔30

13、s測1次吸光值，連續(xù)記錄3min，調(diào)節(jié)連苯三酚溶液用量，將其自氧化速率控制在0.070（±0.002）D/min。經(jīng)實(shí)驗(yàn)測得連苯三酚溶液的用量為6µ1。,（2）樣品活性測定 在10ml試管中加入pH為8.30的4.5ml50mmol/L K2HPO4-KH2PO4緩沖溶液和一定體積的樣液，在25±0.5℃的恒溫水浴中保溫10min，然后加入在25±0.5℃的恒溫水浴中事先預(yù)熱好的連苯三酚

14、6µ1， （空白管用 10mmol/L HCL代替），迅速搖勻倒入1cm比色皿中，以空白管為參比，在325nm下，每隔30s測1次吸光值，連續(xù)記錄3min，調(diào)節(jié)樣液體積，使樣液中連苯三酚的氧化速度控制在0.035（±0.002）D/min，記錄此時(shí)樣液體積。,五.SOD使用及生產(chǎn)時(shí)的注意事項(xiàng),1.SOD的安全性大量試驗(yàn)和臨床應(yīng)用表明， 無論何種給藥方式，除罕見的超敏反應(yīng)外，SOD對人體無毒性。雖然SOD是Mr在3

15、0 000以上的蛋白質(zhì)， 但卻未發(fā)現(xiàn)具有抗原性， 其原因也正在進(jìn)一步研究中。2.SOD生產(chǎn)時(shí)的注意事項(xiàng)（1）在破碎細(xì)胞時(shí)要注意安全，一定要破碎的徹底（2）PH的控制力度很重要，以及在實(shí)驗(yàn)中的溫度等（3） 要學(xué)會正確使用分光光度計(jì),紫外分光光度法測定蛋白質(zhì)含量,本實(shí)驗(yàn)采用紫外分光光度法測定蛋白質(zhì)含量。蛋白質(zhì)中酪氨酸和色氨酸殘基的苯環(huán)含有共軛雙鍵，因此，蛋白質(zhì)具有吸收紫外光的性質(zhì)，其最大吸收峰位于280 nm附近（不同的蛋白質(zhì)吸收波