煙粉虱超氧化物歧化酶功能基因研究.pdf

1、煙粉虱Bemisia tabaci自十九世紀(jì)末首次發(fā)現(xiàn)以來，現(xiàn)已在全球熱帶、亞熱帶及相鄰溫帶地區(qū)的90多個國家有記錄。近年的分子系統(tǒng)發(fā)育分析和雜交試驗的結(jié)果表明，煙粉虱是一個至少含35個隱種的復(fù)合種，其中少數(shù)隱種已成為世界性農(nóng)業(yè)害蟲。在這些害蟲中，MEAM1(Middle East-Asia Minor1)隱種（原稱為B型煙粉虱）因其強(qiáng)大的入侵能力而倍受關(guān)注，而其強(qiáng)大的入侵能力可能與多種因素有關(guān)，如:逆境生存能力、寄主適應(yīng)能力等。本實驗

2、室前期發(fā)現(xiàn)煙粉虱MEAM1隱種取食感染病毒的植株后，其體內(nèi)的SOD(Superoxide dismutase)活性受到影響，并且溫度脅迫能夠?qū)е聼煼凼璏EAM1體內(nèi)CuZnSOD活性顯著升高，本研究在此基礎(chǔ)上試圖從分子水平揭示煙粉虱SOD在其入侵和防御外界不適條件中的作用機(jī)制，從而為煙粉虱的防控提供理論依據(jù)。結(jié)果如下:
　　 (1)煙粉虱MnSOD(Bt-MnSOD)基因的克隆、表達(dá)以及各種脅迫下活性測定
　　 通過RA

3、CE方法獲得了MEAM1 MnSOD的cDNA全長，并對其序列進(jìn)行了分析。結(jié)果表明Bt-MnSOD cDNA序列全長為1210個堿基。其中開放閱讀框ORF為675個堿基，編碼224個氨基酸，并且含有一個25個氨基酸組成的轉(zhuǎn)運(yùn)肽。同源性分析表明，該基因含有MnSOD的典型特征:4個Mn結(jié)合位點(His54、His102、Asp186、His190)和第186到193的氨基酸序列(DVWEHAYY)都是高度保守的。系統(tǒng)進(jìn)化分析表明該基因是一

4、個線粒體MnSOD。經(jīng)原核表達(dá)和純化獲得了該基因的融合蛋白，并檢測了其在不同溫度下的熱穩(wěn)定性。采用qRT-PCR檢測了該基因在MEAM1不同蟲態(tài)下的表達(dá)量，結(jié)果表明其在偽蛹期的表達(dá)量最高，說明Bt-MnSOD可能在偽蛹期生長發(fā)育的過程中起著重要作用。最后，設(shè)置了三種不同的處理:高低溫、寄主轉(zhuǎn)換、農(nóng)藥處理，結(jié)果表明，這三種處理都會導(dǎo)致MEAM1體內(nèi)MnSOD活性的顯著增加。同時，在寄主轉(zhuǎn)換條件下，用qRT-PCR分別對該基因在MEAM1和

5、AsiaⅡ3兩個引種中的表達(dá)量進(jìn)行了檢測，發(fā)現(xiàn)Bt-MnSOD在MEAM1體內(nèi)表達(dá)量顯著增加，而在AsiaⅡ3中，差異不顯著。我們推測Bt-MnSOD在MEAM1應(yīng)對逆境脅迫和入侵取代AsiaⅡ3的過程中起著重要作用。
　　 (2)煙粉虱胞外CuZuSOD(Bt-ecCuZnSOD)基因的克隆以及逆境脅迫下的表達(dá)量檢測
　　 通過RACE獲得了Bt-ecCuZnSOD基因857bp的序列，其中ORF包括了564個堿基，編

6、碼187個氨基酸，其N端含有一條由24個氨基酸組成的信號肽。和其他物種的CuZnSOD序列進(jìn)行同源性比對發(fā)現(xiàn)，Bt-ecCuZnSOD含有的Cu結(jié)合位點(His81、His83、His98、His155)、Zn結(jié)合位點(His98、His106、His115、Asp118)、半胱氨酸（Cys92和Cys181）以及位于氨基酸79到89的序列(GMHVHEKGDLR)和173到184之間的序列(GNAGRRVACGⅡ)在CuZnSOD中都

7、是保守的。同時，系統(tǒng)進(jìn)化分析表明該基因是一個胞外CuZnSOD。Bt-ecCuZnSOD在MEAM1中隨著蟲體的生長，其表達(dá)量逐漸增加，表明該基因在煙粉虱的生長發(fā)育過程中起著重要作用。在高低溫和寄主轉(zhuǎn)換條件下，用qRT-PCR檢測了Bt-ecCuZnSOD在MEAM1和AsiaⅡ3中表達(dá)量的變化，通過比較分析推測Bt-ecCuZnSOD很可能在MEAM1取代AsiaⅡ3的過程中起著一定的作用。
　　 綜上所述，本研究結(jié)果表明Bt