內蒙古白絨山羊轉VEGF基因細胞系的建立與VEGF基因新剪接變體(VEGF138)的發(fā)現.pdf

1、目的：克隆內蒙古白絨山羊 VEGF基因,構建毛囊特異性表達載體pCDsRed2-KV,穩(wěn)定轉染絨山羊胎兒成纖維細胞,篩選獲得穩(wěn)定表達紅色熒光蛋白和毛囊特異表達VEGF的轉基因的細胞克隆。檢測VEGF基因在皮膚細胞中的表達。此外本研究嘗試發(fā)現新的剪接變體。檢測VEGF138是否存在于內蒙古白絨山羊胎兒成纖維細胞中,檢測內蒙古白絨山羊腦、心臟、肝、脾、腎、肺6種組織中VEGF164、VEGF138和VEGF120三種剪接變體的mRNA豐度。

2、
　　 方法：采用RT-PCR技術克隆內蒙古白絨山羊VEGF基因 cDNA,并進行生物信息學分析。以pCDsRed2載體為基本骨架將VEGF164基因cDNA序列亞克隆到 KAP6-1啟動子下游,接續(xù)連接紅色熒光蛋白表達元件 DsRed,構建VEGF164基因毛囊特異表達載體pCDsRed2-KV。外源表達載體以lipofectamine TM2000介導轉染胎兒成纖維細胞,G418篩選獲得穩(wěn)定轉染的細胞克隆,PCR鑒定外源基因

3、在細胞基因組中的整合。pCDsRed2-KV載體轉染內蒙古白絨山羊皮膚成纖維細胞,RT-PCR檢測VEGF mRNA表達量,Western blot檢測VEGF蛋白的表達。利用Taqman探針熒光實時定量方法確認新發(fā)現的剪接變體VEGF138存在于內蒙古白絨山羊胎兒成纖維細胞中。采用SYSR Green熒光實時定量檢測VEGF164、VEGF138和VEGF120三種剪接變體在內蒙古白絨山羊6中組織中的mRNA豐度。
　　 結果

4、：克隆到內蒙古白絨山羊VEDF基因的三個剪接變體VEGF164、VEGF138和VEGF120的cDNA序列,其中VEGF138是首次發(fā)現。VEGF164cDNA序列573bp,包含了全長ORF,編碼190個氨基酸,N端的26個堿基為信號肽序列；VEGF138 cDNA序列495bp,包含了全長ORF,編碼164個氨基酸,N端的26個堿基為信號肽序列；VEGF120 cDNA序列441bp,包含了全長ORF,編碼146個氨基酸,N端的2

5、6個堿基為信號肽序列。VEGF164、VEGF138和VEGF120三種剪接變體在內蒙古白絨山羊腦、心臟、肝、脾、腎、肺組織中均有表達,但VEGF138的mRNA豐度遠小于VEGF165和VEGF120。測序結果顯示表達載體pCDsRed2-KV中,VEGF164基因正確連接在毛囊特異性啟動子 KAP6-1下游,順序連接CMV啟動子和紅色熒光蛋白基因,載體構建正確。篩選得到轉基因細胞克隆,PCR檢測顯示外源KAP6-1啟動子和VEGF1

6、64基因整合到細胞基因組中。轉染VEGF基因的內蒙古白絨山羊皮膚細胞中,VEGFmRNA表達量和蛋白表達量均有明顯增加。
　　 結論：成功構建穩(wěn)定表達紅色熒光蛋白和毛囊特異表達 VEGF164的真核表達載體,穩(wěn)定轉染絨山羊胎兒成纖維細胞,并為進一步通過轉基因克隆技術獲得毛囊特異性超表達VEGF164基因絨山羊新品系提供了條件。VEGF基因在內蒙古白絨山皮膚細胞中表達為轉基因絨山羊新品系建立提供了理論基礎。VEGF基因在內蒙古白絨