VEGF轉基因絨山羊的檢測.pdf

1、血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial cell growth factor，VEGF），在人和動物的毛囊中可以表達，是毛乳頭細胞的一種自分泌生長因子。研究表明，VEGF與動物毛囊發(fā)育和毛發(fā)生長密切相關。在VEGF轉基因絨山羊的生產(chǎn)中，影響目的基因表達及其作用機理仍有待進一步檢測和探索。
　　本實驗室在2012年通過體細胞克隆技術得到了一批轉VEGF基因的轉基因絨山羊。本研究通過對產(chǎn)絨量顯著提高的一只轉基因絨山

2、羊（37號）和一只產(chǎn)絨量沒有明顯改變的轉基因絨山羊（41號）進行測定，同時與來自同一細胞系的體細胞克隆羊（5號）進行對比，確定目的基因VEGF在轉基因絨山羊體內(nèi)的表達情況，進而為深入探索目的基因的作用機理提供實驗依據(jù)。
　　本研究在DNA、RNA、蛋白以及宏觀水平對這三只轉基因絨山羊進行檢測，得到如下主要結果:
　　1.對三只絨山羊進行產(chǎn)絨量檢測，37號羊抓絨后體重為37.5 kg，產(chǎn)絨量為1095g;41號羊抓絨后體重為3

3、5 kg，產(chǎn)絨量為460g;5號體細胞克隆羊抓絨后體重為36.5kg，產(chǎn)絨量為450g。
　　2.通過PCR初步鑒定，37號羊和41號羊均為陽性，然后進行southern bolt檢測，與PCR結果吻合。
　　3.本實驗以Glucagon基因為內(nèi)參，采用絕對定量PCR法檢測目的基因的拷貝數(shù)。標準曲線為:Log2N(拷貝數(shù))=-0.3881△Ct+0.3093(R2=0.9983，p＜0.001)，計算得到37號和41號轉基因

4、絨山羊的拷貝數(shù)分別為0.82和0.97，結果顯示兩只轉基因羊的目的基因均為單拷貝。
　　4.以GAPDH基因為內(nèi)參，對兩只轉基因絨山羊進行realtime PCR和westernblot檢測，其結果與體細胞克隆羊進行對比。結果顯示，在37號羊中，VEGF在皮膚中的RNA表達量和蛋白表達量分別為3.27和1.82倍，在血液中RNA表達量和蛋白表達量分別為0.49和1.02倍;在41號羊中，VEGF在皮膚中的RNA表達量和蛋白表達量分

5、別為0.93和1.16倍，在血液中RNA表達量和蛋白表達量分別為0.24倍和0.86倍。
　　5.對37號、41號和5號羊皮膚做石蠟切片縱切，并進行免疫熒光染色，在激光共聚焦顯微鏡下成像，并用顯微鏡自帶分析軟件對毛囊及其周圍組織的熒光強度進行測量。結果顯示，VEGF的熒光強度在37號羊的初級毛囊中是5號體細胞克隆羊的1.21倍，在41號羊中為1.07倍。
　　6.對37號、41號和5號羊皮膚做冰凍切片橫切，并進行HE染色。結