CRISPR-Cas9介導(dǎo)敲除內(nèi)蒙古白絨山羊胎兒成纖維細(xì)胞FGF5基因.pdf

1、內(nèi)蒙古白絨山羊是優(yōu)秀的絨山羊品種，產(chǎn)出高品質(zhì)羊絨，在全球享有盛譽(yù)。提高羊絨產(chǎn)量一直是絨山羊品種選育的重要任務(wù)，分子育種為品種改良提供了新手段。RNA引導(dǎo)的CRISPR/Cas9核酸內(nèi)切酶系統(tǒng)是近年發(fā)展起來(lái)的基因定點(diǎn)編輯技術(shù)，它通過(guò)一段短的RNA序列與DNA靶序列通過(guò)堿基互補(bǔ)原則形成雙鏈，后結(jié)合Cas9蛋白在DNA靶位點(diǎn)誘導(dǎo)形成雙鏈斷裂損傷(double-strandedbreak，DSBs)，DSBs修復(fù)時(shí)可以在基因組靶位點(diǎn)引入特殊的基

2、因突變，具有設(shè)計(jì)簡(jiǎn)單，打靶效率高及能在靶位點(diǎn)形成多種突變的優(yōu)點(diǎn)。成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子5（fibroblast growth factor5，F(xiàn)GF5）是影響毛囊周期性活動(dòng)及絨毛生長(zhǎng)的重要生長(zhǎng)因子，是一個(gè)已知的最強(qiáng)有力的控制毛囊從生長(zhǎng)期向休止期轉(zhuǎn)化的因子。敲除FGF5基因可以解除對(duì)毛囊生長(zhǎng)周期的控制，促進(jìn)絨毛生長(zhǎng)。
　　本文針對(duì)內(nèi)蒙古自絨山羊FGF5基因設(shè)計(jì)了特異性的“向?qū)NA”分子（Single guide RNA，sgRNA），

3、并對(duì)該sgRNA的潛在脫靶位點(diǎn)進(jìn)行預(yù)測(cè)，構(gòu)建特異于內(nèi)蒙古白絨山羊FGF5基因的CRISPR/Cas9表達(dá)載體，轉(zhuǎn)染胎兒成纖維細(xì)胞，在pool克隆水平上通過(guò)Surveyor錯(cuò)配酶酶切pool克隆中的FGF5片段并測(cè)序驗(yàn)證，以確定在FGF5基因靶位點(diǎn)發(fā)生了基因敲除。隨機(jī)挑取單個(gè)細(xì)胞培養(yǎng)，建立單克隆細(xì)胞系，對(duì)每個(gè)單克隆細(xì)胞系的基因組進(jìn)行PCR擴(kuò)增并測(cè)序，篩選出定點(diǎn)敲除FGF5基因的內(nèi)蒙古白絨山羊胎兒成纖維細(xì)胞系。
　　結(jié)果表明:通過(guò)生物

4、信息學(xué)分析得到靶向于內(nèi)蒙古白絨山羊基因組FGF5基因的79個(gè)潛在靶位點(diǎn)，從中選取了兩個(gè)sgRNA序列，分別命名為FGF5-1(AGAAGCGCCTCGCACCCAAA)和FGF5-2(CCCTGCCTCCTCCTCCTCCG)。將兩個(gè)sgRNA序列連接于pX330空載體，得到特異于白絨山羊基因組FGF5基因的CRISPR/Cas9表達(dá)載體——pX330-FGF5-1和pX330-FGF5-2。測(cè)序表明載體構(gòu)建正確。
　　利用pX3

5、30-FGF5-1和pX330-FGF5-2轉(zhuǎn)染內(nèi)蒙古白絨山羊胎兒成纖維細(xì)胞，Surveyor錯(cuò)配酶酶切和測(cè)序驗(yàn)證表明成功的在靶位點(diǎn)進(jìn)行了特異性切割和突變。利用流式細(xì)胞儀通過(guò)隨機(jī)挑選得到24個(gè)單克隆細(xì)胞系，特異性擴(kuò)增FGF5基因片段，測(cè)序結(jié)果表明其中4個(gè)細(xì)胞系在靶位點(diǎn)發(fā)生FGF5基因突變。對(duì)這4個(gè)敲除FGF5基因的陽(yáng)性克隆細(xì)胞系進(jìn)行潛在脫靶位點(diǎn)驗(yàn)證，均未發(fā)生基因突變。
　　綜上所述，本文根據(jù)內(nèi)蒙古白絨山羊FGF5基因的基因組序列設(shè)