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文檔簡介
1、褪黑激素(Melatonin,Mel)通過與其高親和性G蛋白偶聯(lián)受體的結(jié)合來發(fā)揮調(diào)節(jié)季節(jié)性繁殖、毛發(fā)生長周期調(diào)控等生物學(xué)功能。褪黑激素在毛發(fā)周期調(diào)控過程中的作用機(jī)理研究的尚未清楚,為了研究褪黑激素在毛發(fā)周期調(diào)中基因調(diào)節(jié)功能,本研究利用脂質(zhì)體法將褪黑激素膜受體1基因(MT1)導(dǎo)入永生化絨山羊皮膚成纖維細(xì)胞中,篩選得到穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞株,為進(jìn)一步研究褪黑激素調(diào)節(jié)毛發(fā)周期的基因調(diào)控模型和褪黑激素的作用機(jī)理奠定了基礎(chǔ)。
研究中將編碼hTE
2、RT基因?qū)雰?nèi)蒙古絨山羊皮膚成纖維細(xì)胞,經(jīng)過 G418篩選得到陽性克隆,經(jīng)擴(kuò)大培養(yǎng)后不斷傳代得到永生化細(xì)胞系。RT-PCR檢測目的基因在陽性克隆中穩(wěn)定表達(dá),生長狀態(tài)良好連續(xù)傳代60代,并將其命名為永生化絨山羊皮膚成纖維細(xì)胞系(hTERT-GSFs)。
表達(dá)載體ppEGFP-N1/MT1的構(gòu)建,通過RT-PCR方法利用絨山羊下丘腦總RNA獲得 MT1基因編碼區(qū) cDNA序列,并將MT1片段連接在真核表達(dá)載體 pEGFP-N1的X
3、holI+SalI位點,構(gòu)建表達(dá)載體 pEGFP-N1/MT1。分析表明本研究所構(gòu)建的表達(dá)載體pEGFP-N1/MT1結(jié)構(gòu)與序列均與預(yù)期設(shè)計相符合。
用脂質(zhì)體法將MT1基因?qū)胗郎q山羊皮膚成纖維細(xì)胞,經(jīng)倒置顯微鏡檢測,采用濾紙片消化法活得表達(dá)綠色熒光蛋白的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞,PCR技術(shù)檢測MT1的表達(dá),實驗組表達(dá) MT1,而對照組細(xì)胞不表達(dá) MT1,表明構(gòu)建的載體具有正常的功能。通過對轉(zhuǎn)基因細(xì)胞基因組DNA的PCR擴(kuò)增,證實外源基
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