MT1基因轉(zhuǎn)染永生化內(nèi)蒙古絨山羊皮膚成纖維細(xì)胞的研究.pdf

1、褪黑激素(Melatonin，Mel)通過與其高親和性G蛋白偶聯(lián)受體的結(jié)合來發(fā)揮調(diào)節(jié)季節(jié)性繁殖、毛發(fā)生長周期調(diào)控等生物學(xué)功能。褪黑激素在毛發(fā)周期調(diào)控過程中的作用機(jī)理研究的尚未清楚，為了研究褪黑激素在毛發(fā)周期調(diào)中基因調(diào)節(jié)功能，本研究利用脂質(zhì)體法將褪黑激素膜受體1基因（MT1）導(dǎo)入永生化絨山羊皮膚成纖維細(xì)胞中，篩選得到穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞株，為進(jìn)一步研究褪黑激素調(diào)節(jié)毛發(fā)周期的基因調(diào)控模型和褪黑激素的作用機(jī)理奠定了基礎(chǔ)。
　　研究中將編碼hTE

2、RT基因?qū)雰?nèi)蒙古絨山羊皮膚成纖維細(xì)胞，經(jīng)過 G418篩選得到陽性克隆，經(jīng)擴(kuò)大培養(yǎng)后不斷傳代得到永生化細(xì)胞系。RT-PCR檢測目的基因在陽性克隆中穩(wěn)定表達(dá)，生長狀態(tài)良好連續(xù)傳代60代，并將其命名為永生化絨山羊皮膚成纖維細(xì)胞系(hTERT-GSFs)。
　　表達(dá)載體ppEGFP-N1/MT1的構(gòu)建，通過RT-PCR方法利用絨山羊下丘腦總RNA獲得 MT1基因編碼區(qū) cDNA序列，并將MT1片段連接在真核表達(dá)載體 pEGFP-N1的X

3、holI+SalI位點，構(gòu)建表達(dá)載體 pEGFP-N1/MT1。分析表明本研究所構(gòu)建的表達(dá)載體pEGFP-N1/MT1結(jié)構(gòu)與序列均與預(yù)期設(shè)計相符合。
　　用脂質(zhì)體法將MT1基因?qū)胗郎q山羊皮膚成纖維細(xì)胞，經(jīng)倒置顯微鏡檢測，采用濾紙片消化法活得表達(dá)綠色熒光蛋白的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞，PCR技術(shù)檢測MT1的表達(dá)，實驗組表達(dá) MT1，而對照組細(xì)胞不表達(dá) MT1，表明構(gòu)建的載體具有正常的功能。通過對轉(zhuǎn)基因細(xì)胞基因組DNA的PCR擴(kuò)增，證實外源基