強化表達(dá)VEGF的骨髓基質(zhì)細(xì)胞系的構(gòu)建及其鑒定.pdf

1、背景：
　　 骨髓基質(zhì)干細(xì)胞(Bone marrow derived mesenchymal stem cell，BMSCs)是源于骨髓的一種多潛能成體干細(xì)胞，其應(yīng)用于細(xì)胞治療的主要優(yōu)勢在于其可以自體移植，因而不存在胚胎干細(xì)胞移植所存在的免疫排斥、倫理學(xué)及致瘤性等方面的限制;取材相對簡單，不像神經(jīng)干細(xì)胞主要位于腦室下帶、海馬等結(jié)構(gòu)中，因而細(xì)胞來源有限，獲得困難。BMSCs移植治療已經(jīng)應(yīng)用于腦缺血及其他一些疾病的臨床研究。

2、　　 BMSCs移植治療腦缺血的實驗研究已經(jīng)有較多文獻報道。通過靜脈途徑、動脈途徑或立體定向腦內(nèi)局部注射移植BMSCs治療大鼠大腦中動脈阻斷模型(MCAO)，均發(fā)現(xiàn)移植的細(xì)胞一方面能定向向缺血灶周圍，參與損傷修復(fù)，另一方面分泌趨化因子，誘導(dǎo)膠質(zhì)細(xì)胞、神經(jīng)干細(xì)胞等向損傷部分游走，或是誘導(dǎo)損傷區(qū)細(xì)胞向神經(jīng)干細(xì)胞分化，增殖，參與損傷修復(fù)，并促進功能的恢復(fù)。由于BMSCs具有分化成神經(jīng)細(xì)胞的能力，直觀上，利用移植的BMSCs發(fā)揮細(xì)胞替代作用重

3、建神經(jīng)環(huán)路是最直接的治療方法。然而，大部分的研究發(fā)現(xiàn)移植的BMSCs只有相當(dāng)少的一部分表達(dá)神經(jīng)元或神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的表面標(biāo)志，而即使這些少量的表達(dá)神經(jīng)組織標(biāo)志的細(xì)胞，目前也沒有電生理的或其他方面的證據(jù)顯示它們具有神經(jīng)細(xì)胞的功能，更無法確定它們是否同其他的神經(jīng)細(xì)胞建立了結(jié)構(gòu)與功能聯(lián)系。
　　 目前的研究顯示，BMSCs的發(fā)揮效應(yīng)機制是多方面的，如:減少缺血半影區(qū)細(xì)胞凋亡、促進內(nèi)源性神經(jīng)干細(xì)胞的增殖、促進缺血區(qū)新血管再生、抑制膠質(zhì)瘢痕增

4、生以及促進軸突再生等。歸結(jié)起來，BMSCs治療腦缺血的機制主要的并不是其替代了缺失的神經(jīng)元，而是其在腦內(nèi)缺血的微環(huán)境的刺激下，發(fā)揮了“分子工廠”的作用，分泌各種營養(yǎng)因子，介導(dǎo)了以上的治療過程。
　　 BMSCs在骨髓中的數(shù)量稀少，因此在應(yīng)用于細(xì)胞移植治療時必須進行體外擴增以獲得足夠多的細(xì)胞。然而，BMSCs同大多數(shù)的成體細(xì)胞一樣，會發(fā)生衰老，主要表現(xiàn)在兩個方面:①隨年齡增長，BMSCs的數(shù)量和質(zhì)量均有明顯下降（而老年人正是腦缺血

5、的高發(fā)人群，是可能的需要細(xì)胞移植治療的主體）;②BMSCs在體外傳代過程中，細(xì)胞形態(tài)會逐漸發(fā)生變化（由細(xì)梭形變成寬扁平狀），細(xì)胞的增殖能力、分化潛力、乃至向病灶區(qū)歸巢的能力均會逐漸減弱或喪失。
　　 BMSCs發(fā)生衰老的機制尚不清楚，但目前已知的一個重要原因是BMSCs不表達(dá)端粒酶。人端粒酶是一種核糖核蛋白，其最重要的兩個組份是人端粒酶催化亞單位(hTERT)和模板RNA(hTR)，其中hTR持續(xù)表達(dá)，而hTERT在大部分成體細(xì)

6、胞中并不表達(dá)。端粒酶不同于一般的DNA聚合酶，它是一種專一的逆轉(zhuǎn)錄酶，用自身的RNA成份的互補序列作模板，催化TTAGGG重復(fù)序列加到染色體末端，從而來維持端粒的長度。而組成染色體未端的端粒結(jié)構(gòu)的維持與細(xì)胞的增殖能力密切相關(guān)。大部分的成體細(xì)胞，端粒的長度隨著細(xì)胞的復(fù)制而縮短，因而也限制了細(xì)胞的增殖能力。相反，腫瘤細(xì)胞和胚胎干細(xì)胞則能通過端粒酶的活化來維持端粒的功能。
　　 由于BMSCs不表達(dá)端粒酶，因此隨著細(xì)胞分裂，端粒長度逐

7、漸縮短，最后達(dá)到10Kb左右的閾值的時候，細(xì)胞就會停止分裂，發(fā)生生長停滯。Baxter MA等研究表明，BMSCs平均端粒長度隨年齡的增長而縮短（17 bp/年），而在體外擴增7～10 PDs（Population Doublings，群體倍增次數(shù)）平均丟失的端粒長度就約為1 Kb。這種丟失的速率是驚人的，因為即便是來源于年青人的BMSCs，其生命歷程中端?？s減的長度最高也只能達(dá)到2.5～3.5 Kb。因此，如果沒有采取特殊的處理方法，

8、在體外充分?jǐn)U增BMSCs再回輸回病人體內(nèi)的過程中，實際上已經(jīng)大大縮短了BMSCs的壽命。
　　 為了延長BMSCs的生命周期，或是其他一些科研目的的需要，諸多實驗室進行了BMSCs永生化的探索。用人乳頭狀瘤病毒（HPV）E6/E7基因、猿猴病毒40(SV40)大T抗原基因或bmi-1等癌基因來修飾BMSCs，均能成功地建立永生化BMSCs細(xì)胞系。這些癌基因均能激活人端粒酶催化亞單位基因hTERT的表達(dá)，因此能夠保持細(xì)胞在擴增過程

9、中的端粒長度，然而，使用癌基因修飾所建立的BMSCs細(xì)胞系最主要的問題是染色體不穩(wěn)定，有致細(xì)胞惡性變的風(fēng)險，而難以用于臨床移植治療。
　　 近幾年來，有多家實驗室采用hTERT來轉(zhuǎn)染并成功獲得BMSCs永生細(xì)胞系。此法建立的細(xì)胞系在體外長期培養(yǎng)擴增中端粒長度沒有明顯縮短，保持了同原代BMSCs相似甚至更好的增殖及多向分化潛能。更為重要的是，用hTERT轉(zhuǎn)染建立的BMSCs細(xì)胞系在體外長期培養(yǎng)后仍保持了正常的染色體組型，細(xì)胞的生長

10、存在接觸抑制，體內(nèi)、體外實驗均沒有明顯的致瘤性。
　　 除了BMSCs，其他一些成體細(xì)胞如:皮膚成纖維細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞、皮膚角化細(xì)胞、乳腺上皮細(xì)胞、皮膚黑色素細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、乃至由BMSCs誘導(dǎo)分化所得的成骨細(xì)胞，均可以通過轉(zhuǎn)染hTERT基因的方法永生化。在既往的這些用hTERT基因修飾的研究中，均沒有發(fā)現(xiàn)細(xì)胞明顯的惡性變。
　　 BMSCs是否表達(dá)血管內(nèi)皮生長因子受體(Vascular endothelial gro

11、wthfactorreceptor，VEGFR)，不同的實驗有不同的報道。但是成年人BMSCs是不表達(dá)VEGFR，但是表達(dá)PDGFR-A，PDGFR-B和NRP-1，VEGF可通過VEGFR共軛的PDGFR發(fā)揮其作用，而且也可以通過NRP1增強其效應(yīng)。腦缺血由于腦血管的動脈粥樣硬化或是腦血管的閉塞導(dǎo)致神經(jīng)功能失調(diào)，VEGF可以促進缺血區(qū)血管內(nèi)皮細(xì)胞的趨化和聚集，誘導(dǎo)新生血管的形成，從而增加缺血區(qū)的養(yǎng)分供應(yīng)，減輕缺血引起的神經(jīng)功能學(xué)障礙，

12、因此，構(gòu)建VEGF基因過表達(dá)的老年人BMSCs將具有重大臨床應(yīng)用價值。
　　 本實驗將構(gòu)建hTERT慢病毒載體和VEGF基因慢病毒載體，探討以hTERT慢病毒載體和VEGF基因慢病毒載體聯(lián)合修飾老年人BMSCs，建立強化表達(dá)VEGF的細(xì)胞系的可行性，并對hTERT慢病毒載體和VEGF基因慢病毒載體聯(lián)合修飾的BMSCs進行表型鑒定及功能學(xué)研究。由于BMSCs含有自體的遺傳信息，研究成果將有助于探索制備個體化的(patient-sp

13、ecific)、針對腦缺血治療的(disease-specific)干細(xì)胞產(chǎn)品，也會為進一步的實驗研究打下堅實的基礎(chǔ)。
　　 目的：
　　 骨髓基質(zhì)細(xì)胞(BMSCs)移植是治療腦缺血的一個有效策略，然而，BMSCs隨年齡增長以及在體外擴增過程中會發(fā)生衰老，這阻礙了它的臨床治療應(yīng)用。本研究擬以人端粒酶催化亞單位(hTERT)基因慢病毒表達(dá)載體和血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子(VEGF)基因慢病毒表達(dá)載體雙基因聯(lián)合修飾老年人的BMSC

14、s，探索構(gòu)建強化表達(dá)VEGF的永生化BMSCs系，檢測其生物學(xué)特征。由于BMSCs含有自體的遺傳信息，研究成果將有助于探索制備個體化的(patient-specific)、針對腦缺血治療的(disease-specific)干細(xì)胞產(chǎn)品，也會為進一步的實驗研究打下堅實的基礎(chǔ)。
　　 材料與方法：
　　 1、hTERT基因慢病毒載體和VEGF基因慢病毒載體的構(gòu)建
　　 ①在體外通過PCR技術(shù)擴增hTERT與VEGF基

15、因片段。
　　 ②構(gòu)建pENTR11-hTERT-IRES-EGFP和pENTR11-VEGF-IRES-EGFP入門載體。
　　 ③構(gòu)建 pLenti6/V5-DEST-hTERT-IRES-EGFP和pLenti6/V5-DEST-VEGF-IRES-EGFP表達(dá)載體。
　　 ④慢病毒載體pLenti6/V5-DEST-hTERT-IRES-EGFP和pLenti6/V5-DEST-VEGF-IRES-EGF

16、P的包裝、表達(dá)及分析。
　　 2、探討以hTERT基因慢病毒載體和VEGF基因慢病毒載體聯(lián)合修飾老年人BMSCs，建立強化表達(dá)VEGF的細(xì)胞系的可行性
　　 ①老年人BMSCs購自生物公司，或從臨床志愿者（老年人）抽取骨髓，密度梯度離心法結(jié)合貼壁法獲取BMSCs。
　　 ②分組:BMSCs未修飾組、空載慢病毒修飾組、VEGF基因修飾組、hTERT基因修飾組、hTERT/VEGF雙基因修飾組（各基因修飾組以殺稻瘟篩

17、選穩(wěn)定表達(dá)克?。?br>　　 ③熒光顯微鏡和透射電鏡觀察不同代別細(xì)胞形態(tài)的變化;流式細(xì)胞技術(shù)法檢測不同代別細(xì)胞表面標(biāo)記物的變化;RT-PCR法檢測細(xì)胞hTERT和VEGFmRNA水平;免疫細(xì)胞熒光化學(xué)法和Western blot法檢測細(xì)胞蛋白表達(dá)水平。
　　 3、以hTERT/VEGF雙基因修飾的BMSCs表型及功能學(xué)研究
　　 ①分組:BMSCs未修飾組、空載慢病毒修飾組、VEGF基因修飾組、hTERT基因修飾組、

18、hTERT/VEGF雙基因修飾組
　　 ②流式細(xì)胞儀檢測各組細(xì)胞表型特征;透射電鏡觀察細(xì)胞超微結(jié)構(gòu);共聚焦顯微鏡觀察經(jīng)免疫熒光細(xì)胞染色標(biāo)記的重組細(xì)胞;MTT實驗和平板克隆實驗檢測細(xì)胞生長和增殖能力;單細(xì)胞劃痕實驗和Transwell小室法檢測細(xì)胞遷移侵襲能力;RHG條帶染色體組型分析評估染色體穩(wěn)定性;裸鼠接種腫瘤形成實驗檢驗重組細(xì)胞的致瘤性;TRAP-ELISA法檢測細(xì)胞端粒酶活性和細(xì)胞分泌VEGF水平。
　　 4、所有

19、原始數(shù)據(jù)用(x)±s表示，用SPSS13.0軟件進行One Way ANOVA統(tǒng)計學(xué)分析，組間比較采用LSD法。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　 結(jié)果：
　　 1、成功構(gòu)建hTERT基因慢病毒載體和VEGF基因慢病毒載體。
　　 ①以pEGFP-hTERT、pEGFP-VEGF(165)質(zhì)粒（本實驗室現(xiàn)有）為模板成功擴增hTERT基因和VEGF基因;
　　 ②先用EcoRⅠ、NotⅠ酶切pENTR1

20、1入門載體和pIRES載體，從pIRES載體切下的含IRES序列的片段用T4 DNA連接酶連入pENTR11構(gòu)建pENTR11-IRES，重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞，篩選后，PCR、酶切及測序鑒定，成功獲得pENTR11-IRES。
　　 ③再用NcoⅠ、EcoRⅠ酶切pENTR11-IRES質(zhì)粒和hTERT基因或VEGF基因PCR產(chǎn)物，將hTERT片段或是VEGF片段用T4 DNA連接酶連入載體獲得pENTR11-hTER

21、T-IRES或是pENTR11-VEGF-IRES質(zhì)粒，經(jīng)酶切、測序鑒定;最后用XboⅠ、NotⅠ酶切pENTR11-hTERT-IRES或是pENTR11-VEGF-IRES質(zhì)粒和帶綠色熒光標(biāo)記的EGFP基因PCR產(chǎn)物，T4 DNA連接酶連接構(gòu)建pENTR11-hTERT-IRES-EGFP或是pENTR11-VEGF-IRES-EGFP質(zhì)粒，經(jīng)酶切、測序鑒定;成功獲得 pENTR11-hTERT-IRES-EGFP和pENTR11-

22、VEGF-IRES-EGFP入門載體。
　　 ④將制備的pENTR11-hTERT-IRES-EGFP和pENTR11-VEGF-IRES-EGFP入門克隆、表達(dá)載體pLenti6N5-DEST與GatewayTM LR ClonaseTM enzymeⅡ mix混合反應(yīng)，構(gòu)建攜帶雙基因的慢病毒表達(dá)載體pLenti6/V5-DEST-hTERT-IRES-EGFP和pLenti6/V5-DEST-VEGF-IRES-EGFP，將

23、連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化進Stb13TM E.coli細(xì)胞中，篩選陽性克隆鑒定。成功獲得pLenti6/V5-DEST-hTERT-IRES-EGFP和pLenti6/V5-DEST-VEGF-IRES-EGFP目的基因的表達(dá)載體。
　　 ⑤用Lipofectamine2000將pLenti6N5-DEST-hTERT-IRES-EGFP或（和）pLenti6/V5-DEST-VEGF-IRES-EGFP目的基因質(zhì)粒直接轉(zhuǎn)染入COS-7細(xì)胞

24、系進行瞬時表達(dá)，獲得重組蛋白，驗證構(gòu)建的慢病毒載體表達(dá)情況，結(jié)果滿意。
　　 2、成功獲得強化表達(dá)VEGF永生化BMSCs細(xì)胞系，并對其進行鑒定。
　　 ①利用ViraPowerTM Lentiviral Expression System將純化的重組質(zhì)粒和包裝混合物共轉(zhuǎn)染293FT細(xì)胞系，從293FT細(xì)胞系收集病毒上清液，進行滴度測定;在合適的MOI下用病毒上清轉(zhuǎn)染骨髓基質(zhì)細(xì)胞;用殺稻瘟篩選產(chǎn)生穩(wěn)定表達(dá)pLenti6/

25、V5-DEST-hTERT-IRES-EGFP或（和）pLenti6/V5-DEST-VEGF-IRES-EGFP的細(xì)胞株;經(jīng)RT-PCR和Western-blot檢測確定mRNA和蛋白正確表達(dá)和具有較高的活性。
　　 ②光學(xué)顯微鏡下觀察，原代細(xì)胞剛接種時懸浮于DMEM液體培養(yǎng)基中，呈圓形，細(xì)胞核位于胞漿中央。一般于接種后2-4h原代細(xì)胞開始貼壁，48h后大部分原代細(xì)胞貼壁。更換培養(yǎng)液去除未貼壁細(xì)胞后可見貼壁細(xì)胞形態(tài)多樣，呈梭形

26、或多角形，細(xì)胞核較大、扁圓形，胞漿可向不同方向伸出偽足。貼壁原代細(xì)胞以分散的集落克隆方式迅速增殖，1W左右每個集落約含有數(shù)百個細(xì)胞，細(xì)胞形態(tài)基本為成纖維細(xì)胞樣的長梭形。傳代細(xì)胞一般于接種后1-2h開始貼壁，24h內(nèi)完全貼壁，剛傳代時細(xì)胞呈寬大扁平的多邊形，6-7d細(xì)胞完全匯合，細(xì)胞變細(xì)長，形態(tài)呈成纖維細(xì)胞樣。
　　 ③透射電鏡觀察不同代別BMSCs細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)，沒有發(fā)現(xiàn)明顯的結(jié)構(gòu)改變。
　　 ④流式細(xì)胞技術(shù)法檢測不同代別

27、的BMSCs細(xì)胞表面標(biāo)記物CD29、CD34、CD44、CD45、CD90和CD105的表達(dá)水平，原代細(xì)胞CD44、CD90呈陽性表達(dá)，CD29呈弱陽性表達(dá)，而CD34、CD45、CD133基本不表達(dá);傳代細(xì)胞(P3，P9) CD44、CD90呈陽性表達(dá)，CD29呈弱陽性表達(dá)，而CD34、CD45、CD133基本不表達(dá)，和原代細(xì)胞基本一致。
　　 ⑤RT-PCR、Western-blot和免疫熒光細(xì)胞化學(xué)法檢測確定不同組別mRN

28、A和蛋白正確表達(dá)和具有較高的活性。
　　 3.成功構(gòu)建hTERT/VEGF雙基因修飾的BMSCs細(xì)胞系并對其表型及功能學(xué)研究
　　 ①流式細(xì)胞技術(shù)法檢測不同組別的BMSCs細(xì)胞表面標(biāo)記物CD29、CD34、CD44、CD45、CD90和CD105的表達(dá)水平，各組別均出現(xiàn)CD44、CD90呈陽性表達(dá)，CD29呈弱陽性表達(dá)，而CD34、CD45、CD133基本不表達(dá)。
　　 ②透射電鏡觀察不同組別的BMSCs細(xì)胞超微

29、結(jié)構(gòu)，結(jié)果表明，表達(dá)VEGF基因的BMSCs細(xì)胞出現(xiàn)WP小體，質(zhì)膜小泡和分泌vWF等，其他組別均不表達(dá)。
　　 ③激光共聚焦顯微鏡觀察不同組別的BMSCs細(xì)胞蛋白的表達(dá)，結(jié)果表明，各組別BMSCs細(xì)胞均能表達(dá)CD31和UEA-1，而只有表達(dá)VEGF的BMSCs細(xì)胞才能表達(dá)vWF蛋白。
　　 ④RHG條帶染色體分析法分析不同組別的BMSCs細(xì)胞核型的變化，結(jié)果表明，各組別BMSCs細(xì)胞核型一致，沒有出現(xiàn)遺傳性變異。

30、　　 ⑤MTT實驗和平板克隆實驗檢測不同組別的BMSCs細(xì)胞生長和增殖能力，結(jié)果表明，表達(dá)hTERT基因BMSCs細(xì)胞生長和增殖能力明顯增強。
　　 ⑥單細(xì)胞劃痕實驗和Transwell小室法檢測不同組別的BMSCs細(xì)胞遷移侵襲能力，結(jié)果表明，表達(dá)hTERT基因或是VEGF基因的BMSCs細(xì)胞遷移能力增強，而各組BMSCs細(xì)胞均沒有出現(xiàn)侵襲能力。
　　 ⑦裸鼠接種腫瘤形成實驗檢驗不同組別的BMSCs細(xì)胞的致瘤性，結(jié)果表

31、明，各組別BMSCs細(xì)胞均不具有致瘤性。
　　 ⑧TRAP-ELISA法檢測不同組別的BMSCs細(xì)胞端粒酶活性和細(xì)胞分泌VEGF水平，結(jié)果表明，表達(dá)hTERT基因的BMSCs端粒酶活性增強，hBMSC-T及hBMSC-V&T組的相對端粒酶活性(RTA)分別為57.9±3.1和55.3±1.3，而表達(dá)VEGF基因的hBMSCs分泌VEGF增加，hBMSC-V及hBMSC-V&T組的細(xì)胞上清液中VEGF分泌量分別為3935±154

32、pg/ml和3749.8±164 pg/ml。
　　 結(jié)論
　　 本實驗將構(gòu)建hTERT慢病毒載體和VEGF基因慢病毒載體，探討以hTERT慢病毒載體和VEGF基因慢病毒載體聯(lián)合修飾老年人BMSCs，建立強化表達(dá)VEGF的細(xì)胞系的可行性，并對hTERT慢病毒載體和VEGF基因慢病毒載體聯(lián)合修飾的BMSCs進行表型鑒定及功能學(xué)研究。通過上述研究我們得到了以下結(jié)論:
　　 1.hTERT基因慢病毒載體和VEGF基因慢

33、病毒載體聯(lián)合修飾老年人BMSCs，建立強化表達(dá)VEGF的BMSCs細(xì)胞系是可行的，具有重要的臨床價值。
　　 2.hTERT基因慢病毒載體和VEGF基因慢病毒載體聯(lián)合修飾老年人BMSCs，能夠表達(dá)BMSCs細(xì)胞表面具有的特征，在體外能夠無限制的擴增，具有分泌VEGF蛋白的功能。
　　 3.hTERT基因慢病毒載體和VEGF基因慢病毒載體聯(lián)合修飾老年人BMSCs細(xì)胞，具有較快的生長增殖能力，較強的遷移能力，不具有侵襲性和致