內(nèi)蒙古絨山羊皮膚干細(xì)胞定位的初步研究.pdf

1、本論文旨在探討B(tài)rdU標(biāo)記內(nèi)蒙古絨山羊皮膚組織的可行性及免疫組織化學(xué)檢測(cè)的最優(yōu)條件，并對(duì)皮膚干細(xì)胞的分布位置、遷移軌跡進(jìn)行初步研究。通過對(duì)絨山羊頸部靜脈注射不同劑量BrdU，活體取背部皮樣，經(jīng)4％多聚甲醛固定，石蠟包埋切片，免疫組織化學(xué)技術(shù)檢測(cè)不同的BrdU注射劑量、二抗及鏈霉菌抗生物素—過氧化物酶濃度、抗原修復(fù)方式、DNA變性溫度對(duì)BrdU標(biāo)記結(jié)果的影響，以尋求檢測(cè)的最佳條件。同時(shí)，根據(jù)干細(xì)胞的標(biāo)記滯留性，觀察BrdU標(biāo)記在皮膚中的分

2、布位置。選擇BrdU標(biāo)記滯留期的絨山羊背部皮樣，對(duì)標(biāo)記物集中分布的部位進(jìn)行體外分離培養(yǎng)，并對(duì)同期皮膚組織進(jìn)行干細(xì)胞表面標(biāo)志P63的鑒定。結(jié)果表明： 實(shí)驗(yàn)組山羊皮膚組織中有紅色的BrdU陽(yáng)性細(xì)胞的分布，其以PBS代替一抗的陰性對(duì)照以及未注射BrdU的空白對(duì)照山羊皮膚組織中無BrdU陽(yáng)性細(xì)胞出現(xiàn)。不同BrdU標(biāo)記劑量對(duì)免疫組織化學(xué)染色效果無明顯區(qū)別；當(dāng)2M HCl37℃變性30min，胰蛋白酶37℃修復(fù)30min，生物素標(biāo)記的第二抗

3、體和鏈霉菌抗生物素—過氧化物酶的稀釋度為1：100時(shí)，免疫組化檢測(cè)結(jié)果最理想。 BrdU可以用于內(nèi)蒙古絨山羊短時(shí)期的體內(nèi)標(biāo)記，在本實(shí)驗(yàn)中，標(biāo)記存留時(shí)間為10周。標(biāo)記滯留細(xì)胞存在于初級(jí)毛囊、次級(jí)毛囊以及表皮基底層，并且主要集中分布在毛球部以及外根鞘，并發(fā)現(xiàn)標(biāo)記滯留細(xì)胞有向上遷移的現(xiàn)象。 在此基礎(chǔ)上，取BrdU標(biāo)記的絨山羊背頸部皮膚，用酶消化法和機(jī)械法分離完整毛囊，對(duì)毛球部及外根鞘的細(xì)胞進(jìn)行體外分離、Ⅳ型膠原黏附篩選，經(jīng)培