含外源T細(xì)胞表位的豬細(xì)小病毒VP2基因真核表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建及免疫原性研究.pdf

1、豬細(xì)小病毒(Porcine parvovirus,PPV)主要引起初產(chǎn)母豬的繁殖障礙。PPV除單純感染豬以外,該病毒與豬圓環(huán)病毒(Porcine circovirus Type 2,PCV-2)的混合感染更為普遍。這兩種傳染病在豬場(chǎng)并發(fā)或繼發(fā)感染現(xiàn)象較為普遍,給養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。豬細(xì)小病毒是一種自主復(fù)制性DNA病毒,VP2衣殼蛋白是PPV的主要保護(hù)性抗原,而且具有很高的保守性。PCV-2基因組位于ORF1內(nèi)201-220位氨基

2、酸的多肽P21,為一免疫優(yōu)勢(shì)T細(xì)胞表位,免疫動(dòng)物后,動(dòng)物體內(nèi)的淋巴細(xì)胞明顯增多,而且免疫動(dòng)物血清中PCV-2特異的抗體水平亦明顯升高,是研制抗原表位疫苗的優(yōu)勢(shì)目標(biāo)表位。本研究選擇豬細(xì)小病毒VP2基因以及豬圓環(huán)病毒2型多肽P21為目的基因,為了制備能夠同時(shí)預(yù)防PPV和PCV-2兩種病毒感染的DNA疫苗,本試驗(yàn)構(gòu)建了共表達(dá)VP2基因和P21基因的重組質(zhì)粒pcDNA-P21-VP2,并用構(gòu)建的重組質(zhì)粒進(jìn)行了小鼠免疫試驗(yàn),分析了重組質(zhì)粒誘導(dǎo)小鼠

3、產(chǎn)生的體液免疫和細(xì)胞免疫反應(yīng)。
　　 本研究對(duì)分離的PPV在PK15細(xì)胞上進(jìn)行增殖,根據(jù)Genbank報(bào)告的NADL-2參考毒株VP2基因的核苷酸序列,利用Primer5.0軟件,設(shè)計(jì)合成一對(duì)引物,以PPV病毒的DNA為模板,應(yīng)用PCR擴(kuò)增VP2基因片段,將該基因片段克隆到pMD-18T載體,并進(jìn)行了酶切、PCR鑒定和序列測(cè)定。將從pMD-18T-VP2中酶切純化后的VP2基因克隆至真核表達(dá)載體pcDNA3.1(+)的BamH

4、I和Xho I之間的多克隆位點(diǎn)上,并在VP2基因的5'端插入用酶促合成方法獲得豬圓環(huán)病毒2型的T細(xì)胞表位基因P21,構(gòu)建重組質(zhì)粒pcDNA-P21-VP2。經(jīng)酶切鑒定,結(jié)果表明VP2基因與P21基因均正確插入到載體中。
　　 重組質(zhì)粒pcDNA-P21-VP2,經(jīng)磷酸鈣介導(dǎo)轉(zhuǎn)染HEK293T細(xì)胞,使其在真核細(xì)胞中進(jìn)行表達(dá),經(jīng)SDS-PAGE、Western-blot檢測(cè)分析表達(dá)的重組蛋白。試驗(yàn)結(jié)果表明,表達(dá)的重組蛋白大小約為67