鵝細(xì)小病毒VP3基因克隆及真核表達(dá)載體的構(gòu)建.pdf

1、本實(shí)驗(yàn)選用鵝細(xì)小病毒四平分離珠VP3基因?yàn)楹蜻x基因，利用堿裂解法提取GPV基因組DNA。應(yīng)用Primer5.0在VP3基因兩側(cè)設(shè)計(jì)一對(duì)引物P1/P2，利用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)從GPV基因組DNA擴(kuò)增出VP3基因片段。將VP3基因與克隆載體pMDl8-T連接，轉(zhuǎn)化到感受態(tài)大腸桿菌JM-109中進(jìn)行克隆。對(duì)所提質(zhì)粒進(jìn)行快速鑒定、PCR鑒定以及限制性內(nèi)切酶NheI和BamHI雙酶切鑒定，篩選陽(yáng)性重組質(zhì)粒，對(duì)重組質(zhì)粒測(cè)序并進(jìn)行核苷酸序列分析。結(jié)果表明

2、：GPV四平(SP)株VP3基因長(zhǎng)l605nt，包含了完整編碼GPVVP3蛋白閱讀框，且與國(guó)內(nèi)GPV分離株B株相應(yīng)核苷酸序列和氨基酸序列的同源性較高，為96.2﹪和97.4﹪，由此說(shuō)明，GPV四平株VP3基因可以用于構(gòu)建具有普遍應(yīng)用價(jià)值的基因工程疫苗的候選基因。 之后，通過(guò)一系列酶切連接反應(yīng)將VP3基因成功克隆入真核表達(dá)載體pVAXI，構(gòu)建了含有VP3基因的真核表達(dá)載體pVAXI-VP3。通過(guò)脂質(zhì)體法把pVAXI-VP3轉(zhuǎn)入真核

3、細(xì)胞Vero進(jìn)行表達(dá)。轉(zhuǎn)染Vero細(xì)胞后，繼續(xù)培養(yǎng)細(xì)胞，通過(guò)離心方法將細(xì)胞離心，提取細(xì)胞的總RNA，并反轉(zhuǎn)錄成cDNA，以cDNA為模板，以P1/P2為引物在mRNA水平檢測(cè)外源基因的轉(zhuǎn)錄情況。同時(shí)利用熒光抗體技術(shù)，在蛋白質(zhì)水平對(duì)外源基因的表達(dá)情況進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果表明，RT-PCR結(jié)果可見在1000-2000bp之間可見一DNA條帶；免疫熒光法對(duì)表達(dá)后蛋白進(jìn)行檢測(cè)，可見特異性熒光。由此說(shuō)明，本實(shí)驗(yàn)構(gòu)建的pVAXI-VP3真核表達(dá)質(zhì)粒能在真