PCV2優(yōu)勢(shì)T、B細(xì)胞表位與截短cap基因串聯(lián)的構(gòu)建、原核表達(dá)及免疫原性研究.pdf

1、豬圓環(huán)病毒2型（PCV2）是目前全球養(yǎng)豬業(yè)具有重要經(jīng)濟(jì)意義的重要病毒性病原體之一，現(xiàn)將與其感染相關(guān)的疾病統(tǒng)稱為豬圓環(huán)病毒相關(guān)病（PCVAD），其中危害最嚴(yán)重的是仔豬斷奶后多系統(tǒng)衰竭綜合征（PMWS）。PCV2主要侵害機(jī)體的免疫系統(tǒng)，造成嚴(yán)重的免疫抑制，從而容易發(fā)生其他致病性微生物的繼發(fā)或混合感染，嚴(yán)重危害豬群健康。自2006年豬圓環(huán)病毒2型疫苗問(wèn)世以來(lái)，疫苗的免疫接種成為防治豬圓環(huán)病毒病的主要手段。目前四種商品化疫苗已在世界范圍內(nèi)廣泛使

2、用，其中兩種都是以PCV2 Cap蛋白作為免疫原，實(shí)驗(yàn)和現(xiàn)場(chǎng)研究已經(jīng)清晰地表明PCV2疫苗具有降低病毒血癥、消除 PCVAD、增加生長(zhǎng)性能等方面的功效，但是在免疫接種的豬群中仍然會(huì)發(fā)生 PCVAD，這意味著現(xiàn)有商品化疫苗的免疫接種無(wú)法完全阻止 PCV2感染或傳播；此外，還有全病毒培養(yǎng)獲得的病毒滴度低、滅活不徹底導(dǎo)致毒力返強(qiáng)、價(jià)格昂貴和保護(hù)率差等可能性。因此，開發(fā)新的安全有效的疫苗對(duì)控制PCV2感染是十分必要的。
　　PCV2 OR

3、F2編碼的Cap蛋白是病毒主要的結(jié)構(gòu)蛋白并且具有型特異性表位，一直以來(lái)也是PCV2重組疫苗的靶向物，但是針對(duì)其他因素對(duì)Cap蛋白免疫原性影響的研究卻很少。因此，本研究致力于尋找一種能增強(qiáng)Cap蛋白免疫原性的方法以期提高Cap蛋白亞單位疫苗的免疫效果。為了在原核表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)PCV2截短Cap蛋白與T、B細(xì)胞表位的串聯(lián)重組蛋白，并評(píng)價(jià)其免疫原性，我們根據(jù)之前的報(bào)道分別篩選了Rep和Cap蛋白上的T、B細(xì)胞表位后送去合成基因，然后將截短cap

4、基因和合成的表位基因依次插入到pET-32a載體，共獲得三種重組質(zhì)粒： pET-B-cap、pET-T-cap和pET-T-B-cap。依次PCR、雙酶切和DNA測(cè)序鑒定，結(jié)果證明成功構(gòu)建三種重組表達(dá)質(zhì)粒，之后轉(zhuǎn)化E. coliBL21(DE3)感受態(tài)，在IPTG誘導(dǎo)下表達(dá)。表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)SDS-PAGE和Western blot分析驗(yàn)證，大小分別約為49、46和54 kDa，主要以包涵體形式存在，并具有較好的反應(yīng)原性。分別用獲得的rB-C

5、ap、rT-Cap和rT-B-Cap蛋白制備的疫苗免疫SPF級(jí)BALB/ c小鼠，間接ELISA抗體檢測(cè)結(jié)果顯示以上疫苗都能激發(fā)較高水平的Cap蛋白抗體，其中以rT-B-Cap組的抗體水平最高，且顯著高于rCap和商品化全病毒滅活疫苗組，表明同時(shí)串聯(lián)T、B優(yōu)勢(shì)抗原表位的Cap蛋白免疫原性得到提高。優(yōu)勢(shì)表位串聯(lián)Cap蛋白較好的抗原性凸顯了以Cap蛋白為基礎(chǔ)的疫苗在防治PCV2病毒感染方面的顯著效果，并且也可能提供了一種用于提高基于表位的疫