IBDV-VP2多表位串聯(lián)基因的原核表達(dá)及表達(dá)產(chǎn)物免疫原性分析.pdf

1、傳染性法氏囊病(Infectious bursal disease,IBD)是由傳染性法氏囊病病毒(Infectious bursal disease virus,IBDV)引起雞的急性、高度接觸性傳染病,是危害世界養(yǎng)禽業(yè)的主要傳染病之一。該病毒主要侵害雞的中樞免疫器官——法氏囊,從而導(dǎo)致免疫抑制,造成對(duì)其他疫病的易感性增強(qiáng)。近年來(lái),IBDV分子生物學(xué)研究雖然取得了較大進(jìn)展,但在分子水平對(duì)IBDV的免疫機(jī)理、致病機(jī)制、病毒分子的結(jié)構(gòu)與功

2、能方面仍有許多問(wèn)題有待于進(jìn)一步深入研究。而鑒定IBDV抗原表位則有助于揭示病毒與機(jī)體相互作用的本質(zhì),從而進(jìn)一步探索IBDV的致病機(jī)制和免疫機(jī)理。
　　 抗原表位,又稱抗原決定簇,它是蛋白質(zhì)抗原性的物質(zhì)基礎(chǔ),具有刺激機(jī)體產(chǎn)生抗體或致敏淋巴細(xì)胞并能夠與之抗體結(jié)合或致敏淋巴細(xì)胞識(shí)別的特性,在蛋白質(zhì)抗原的結(jié)構(gòu)與功能中扮演著重要的角色?？梢?jiàn)正確而詳細(xì)地繪制抗原表位圖譜對(duì)疾病的診斷、設(shè)計(jì)無(wú)毒副作用的多表位疫苗以及免疫治療試劑等具有積極的意義

3、。目前在預(yù)防醫(yī)學(xué)領(lǐng)域許多關(guān)于以表位為基礎(chǔ)的,如表位疫苗和特異性診斷試劑等的研究也就成了熱點(diǎn)。而多表位疫苗因其攜帶更多的中和表位信息,可以提供更多的保護(hù),本課題以其為出發(fā)點(diǎn),對(duì)IBDV多表位疫苗的分子設(shè)計(jì)及表達(dá)產(chǎn)物的人工保護(hù)試驗(yàn)進(jìn)行了研究,結(jié)果證明該多表位疫苗的研究思路不僅可提供vvIBDV新的防制制劑,而且將為分子免疫學(xué)以及高效基因工程疫苗的研究奠定基礎(chǔ)。本研究共分兩部分:
　　 一、IBDV多表位串聯(lián)基因的原核表達(dá)及免疫原性分

4、析
　　 本研究室前期研究利用4株IBDV-VP2單克隆抗體(McAb)從噬菌體隨機(jī)肽庫(kù)中篩選得到了4個(gè)含有不同IBDV-VP2抗原表位的模擬肽序列。在此基礎(chǔ)上,將4個(gè)抗原模擬表位用GGGS四肽連接構(gòu)建多表位串聯(lián)基因4epis。將該基因合成、克隆后,構(gòu)建原核表達(dá)質(zhì)粒pET-4epis,于大腸桿菌E.coli BL21(DE3)pLysS中表達(dá)重組多表位蛋白r4EPIS。SDS-PAGE分析表明目的蛋白獲得了表達(dá),并以包涵體形式存

5、在,經(jīng)包涵體洗滌、蛋白純化,其純度可達(dá)90％以上,分子量約30kDa。將純化后的表達(dá)產(chǎn)物免疫SPF雞,ELISA分析其抗血清效價(jià)在1:10240以上,Western-blot分析表明表達(dá)產(chǎn)物r4EPIS能與IBDV單克隆抗體發(fā)生反應(yīng),從而證明該多表位基因4epis在原核中得到了表達(dá),且表達(dá)產(chǎn)物具有良好的免疫原性。這為研究超強(qiáng)毒IBDV的免疫機(jī)理及基因工程亞單位疫苗的研制奠定了基礎(chǔ)。
　　 二、IBDV-VP2多表位蛋白的人工保護(hù)

6、試驗(yàn)
　　 本研究選取7日齡SPF雞160只,隨機(jī)分成8組,平均每組20只,按照以下組別進(jìn)行試驗(yàn):對(duì)照組、IBDV疫苗組、弗氏佐劑組、表達(dá)蛋白4EPIS組、VP2抗原組、4EPIS+弗氏佐劑(1:2)(體積比)組、4EPIS+弗氏佐劑(1:1)組和4EPIS+弗氏佐劑(2:1)組。根據(jù)組別分別于14日齡一免、21日齡二免,對(duì)照組則用生理鹽水替代。7d后即28日齡時(shí)進(jìn)行IBDV攻毒,分別于攻毒前、攻毒后的第3d、7d、14d的時(shí)候

7、采樣(胸腺、法氏囊、脾臟、血清等)。進(jìn)行免疫器官指數(shù)、ANAE+淋巴細(xì)胞百分率、血清SOD活性以及抗體效價(jià)等的測(cè)定。試驗(yàn)結(jié)果表明:用200個(gè)ELD50超強(qiáng)毒IBDV攻擊SPF雞,4EPIS+弗氏佐劑(2:1)組攻毒保護(hù)率最高,達(dá)90％以上。說(shuō)明目的蛋白r4EPIS聯(lián)合免疫佐劑構(gòu)建的多表位疫苗能夠促進(jìn)雞體免疫器官的發(fā)育并有效的阻止IBDV對(duì)機(jī)體的損傷,能夠維持較高的抗體水平、顯著提高ANAE+淋巴細(xì)胞百分率和血清SOD活性,從而提高機(jī)體的