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文檔簡介
1、豬細(xì)小病毒(PPV)與偽狂犬病毒(PRV)是引起豬繁殖障礙的兩個主要病原。PPV和PRV引起的疾病在我國有很高的感染率和發(fā)病率,給我國的養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。傳統(tǒng)的常規(guī)疫苗對防制PPV和PRV的感染有一定的效果,但是存在不可避免的缺陷,為了更好的控制PPV和PRV感染,研制更加安全有效的PPV-PRV二價基因工程疫苗是解決這一問題的最好途徑。 偽狂犬病病毒基因組為一雙鏈、線狀DNA,在長約150kb的基因組上存在許多與病毒
2、復(fù)制無關(guān)的非必需基因,這些基因可供外源基因的插入,而使之能成為活載體疫苗。根據(jù)AnaⅠ.Ranz等報道的PPVNADL-2株病毒基因組序列設(shè)計了一對包含其結(jié)構(gòu)蛋白VP2基因的PCR引物,分別在引物的上、下游5’端引入了BamHⅠ酶切位點,以含PPVNADL-2株全部序列的GH質(zhì)粒為模板,擴(kuò)增了完整的PPVVP2基因和部分VP1基因,將擴(kuò)增的目的基因VP2克隆入PMD18-T載體內(nèi),構(gòu)建了重組質(zhì)粒。經(jīng)PCR鑒定證明插入片段是VP2基因,并
3、將重組質(zhì)粒命名為PT-GFP。用BamHⅠ酶切擴(kuò)增的VP2基因和載體PG質(zhì)粒并回收,將載體PG質(zhì)粒去磷酸化后與目的片段VP2基因連接,構(gòu)建了重組質(zhì)粒PG-VP2。通過PCR擴(kuò)增、酶切、序列測定證明,該轉(zhuǎn)移載體構(gòu)建成功。經(jīng)酶切鑒定證明插入片斷是VP2基因片斷,并證明插入方向正確。 利用脂質(zhì)體介導(dǎo)的方法,將轉(zhuǎn)移載體質(zhì)粒PG-VP2與PRV基因組DNA共轉(zhuǎn)染PK-15細(xì)胞。于熒光顯微鏡下48小時便能觀察到綠色熒光,用吸管將有熒光的病變
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