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文檔簡介
1、非洲豬瘟(African Swine Fever,ASF)是由非洲豬瘟病毒(African Swine FeverVirus,ASFV)引起的豬的一種急性、烈性傳染病。臨床上以高熱、全身性出血和高死亡率為特征。該病對養(yǎng)豬業(yè)危害巨大,被OIE列為A類疫病。盡管我國尚無該病的傳入,卻時刻面臨傳入的風(fēng)險。因此,開展該病診斷方法和疫苗的儲備性研究,對于該病的防范具有重要意義。
本研究利用原核表達(dá)的ASFV P72蛋白作為免疫原,制
2、備了P72蛋白的單克隆抗體,并構(gòu)建了P72基因的重組桿狀病毒,為非洲豬瘟的診斷方法和免疫預(yù)防等研究奠定了基礎(chǔ)。
具體研究內(nèi)容如下:
1.P72基因的原核表達(dá)及其單克隆抗體的制備
根據(jù)已發(fā)表的序列,設(shè)計(jì)合成了ASFV P72基因,并將其克隆至原核表達(dá)載體pGEX-KG,得到重組原核表達(dá)質(zhì)粒pKG-P72。將該質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3),經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后,SDS-PAGE檢測證實(shí),P72蛋白
3、以可溶性形式在大腸桿菌中獲得了高效表達(dá)。以純化的P72蛋白作為免疫原,免疫BALB/c小鼠,并通過細(xì)胞融合和間接ELISA方法篩選,獲得了5株能穩(wěn)定分泌針對P72蛋白的特異性單抗的雜交瘤細(xì)胞株,分別命名為1E1、1F3、3F1、3D11、4F10,單抗亞類鑒定均屬于IgG2a。經(jīng)間接免疫熒光和Western Blot分析,獲得的5株單克隆抗體均能與P72原核和真核表達(dá)蛋白發(fā)生特異性反應(yīng)。
2.P72基因重組桿狀病毒的構(gòu)建<
4、br> 在構(gòu)建真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA-P72的基礎(chǔ)上,用BglⅡ+XbaⅠ雙酶切該質(zhì)粒,獲得CMV-P72表達(dá)框,并將其插入到轉(zhuǎn)移載體pFast-VSV-G中,得到重組轉(zhuǎn)移質(zhì)粒pFast-G-P72。將該轉(zhuǎn)移質(zhì)粒轉(zhuǎn)化DH10Bac大腸桿菌感受態(tài),通過藍(lán)白斑篩選得到陽性重組穿梭載體Bacmid-G-P72。將提取的重組Bacmid-G-P72 DNA轉(zhuǎn)染sf9昆蟲細(xì)胞,獲得重組桿狀病毒BV-G-P72。將重組桿狀病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)EPC細(xì)胞,
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