家蠶絲腺中蛋白酶抑制劑的鑒定和功能研究.pdf

1、家蠶是一種鱗翅目昆蟲，由于可以吐絲結繭而被人類馴化。在上個世紀初，家蠶作為一種模式生物，為經(jīng)典遺傳學和生物基礎科學的發(fā)展作出了重大貢獻。目前，家蠶作為鱗翅目模式昆蟲，成為了遺傳學、生理學、分子生物學、細胞生物學和基因組學等生物學科的重要研究對象。
　　家蠶是一種重要的經(jīng)濟昆蟲，其合成和分泌絲蛋白的效率非常高。家蠶泌絲機制的研究也成為了研究熱點。絲腺是家蠶唯一的吐絲器官，從形態(tài)和功能上可以分為三個部分:前部絲腺、中部絲腺和后部絲腺。

2、后部絲腺合成和分泌的絲素蛋白流經(jīng)中部絲腺后被絲膠蛋白包裹，最后通過細長的前部絲腺管腔分泌到體外。在各種因素的綜合作用下，絲素蛋白的構象發(fā)生了巨大的轉變，形成了不溶于水的絲纖維。目前，家蠶絲纖維作為一種天然的高分子材料主要應用于紡織業(yè)，但是其在生物醫(yī)學材料、化妝、保健等領域的應用也越來越廣泛。
　　家蠶能夠在常溫常壓下高效地生產(chǎn)絲纖維，這與絲蛋白在絲腺中復雜的加工過程有關。眾多的研究已經(jīng)揭示，絲腺中離子成分與含量的變化與絲蛋白構象的

3、變化相關。但是，這些研究仍只如管中窺豹，不足以揭示家蠶絲腺中絲纖維形成的整體過程。自從2004年家蠶全基因組數(shù)據(jù)庫向全世界公開以來，家蠶的研究就進入了大數(shù)據(jù)時代。針對發(fā)育、免疫及絲蛋白合成等家蠶的重要生物學性狀，研究者們從基因組學、轉錄組學和蛋白質組學等方面進行了大量的分析和梳理工作，希望能夠從中找到一些復雜的生物學網(wǎng)絡，發(fā)現(xiàn)新的重要的信號通路。
　　絲纖維形成的過程即是絲蛋白構象的變化過程。絲腺腔中除了絲蛋白以外的其它蛋白必然在

4、這個過程中起重要的作用，但到目前為止仍然沒有人研究絲腺腔內究竟存在哪些蛋白以及它們所發(fā)揮的功能。因此，本研究提取了絲腺腔內的蛋白質，進行了高分辨率的shotgun LC-MS/MS蛋白質組學分析，為了揭示絲腺腔內的蛋白質的去向，我們也對蠶絲中的蛋白質進行了鑒定，然后對鑒定到的蛋白質進行了系統(tǒng)的功能注釋和定量分析。LC-MS/MS蛋白質組學分析結果表明，絲腺腔內容物和蠶絲纖維中的蛋白酶抑制劑含量都很高。因此，我們重點分析了絲腺和蠶絲中蛋白

5、酶抑制劑的結構特征和分類，測定了它們的活性，并純化獲得了含量較高的幾個蛋白酶抑制劑。本研究重點對絲腺中Serpin類絲氨酸蛋白酶抑制劑進行了功能研究。由于我們制備的Serpin16抗體能識別三個高度同源的蛋白質:Serpin16、Serpin18和Serpin22，因此我們對這三個Serpin在不同發(fā)育時期和不同區(qū)段絲腺中的變化進行了系統(tǒng)的研究，測定了它們對多種蛋白酶的抑制作用，并證實了其與一種家蠶絲腺分泌的蛋白酶Bmsp82有相互作用

6、。
　　本研究獲得的主要結果如下:
　　1.絲腺腔內容物和蠶絲的shotgun蛋白質組學分析
　　(1)絲腺腔內容物蛋白質的鑒定和定量分析:我們收集了兩個時期的5個區(qū)段的絲腺腔內容物樣品，通過LC-MS/MS鑒定到了1271個蛋白質。通過GO分類注釋，可以將鑒定到的所有蛋白質歸類于11個功能分類。利用iBAQ法進行非標定量分析，發(fā)現(xiàn)絲腺腔內胞外蛋白的種類雖然少，但是豐度遠高于胞內蛋白。絲素和絲膠是絲腺腔內豐度最高的蛋白

7、成分，從5齡第5天到上蔟第1天，3種絲素和絲膠1從中部絲腺中區(qū)和后區(qū)流向了前部絲腺和中部絲腺前區(qū);絲膠2和絲膠3都分布于前部絲腺和中部絲腺前區(qū)腺腔內，但絲膠2下調而絲膠卻3上調。其它豐度較高的蛋白質還有代謝相關蛋白、蛋白酶抑制劑和未知功能蛋白。從5齡第5天到上蔟第1天，在前部絲腺和中部絲腺前區(qū)腺腔內的代謝相關的酶類顯著下調，表明在這兩段絲腺腔內的生化反應發(fā)生了顯著的變化。
　　(2)蠶絲中蛋白質的鑒定和定量分析:對蠶絲樣品進行LC

8、-MS/MS分析，共鑒定到500個蛋白質。通過綜合分析GO分類注釋，我們將鑒定到的蠶絲蛋白質分為了8個功能分類。通過計算各個功能分類下蛋白質的分子豐度比例，發(fā)現(xiàn)絲素和絲膠蛋白、未知功能蛋白和蛋白酶抑制劑構成了蠶絲中三個主要的蛋白分類，其中絲素和絲膠蛋白在7種蠶絲中的分子含量為46.2％～74.7％。相對于蛋白質的分子含量，蛋白質的質量含量更真實地體現(xiàn)了其在樣品中的豐度，由于絲素和絲膠蛋白的分子量(100 kDa～400 kDa)比一般蛋

9、白質的分子量更高，因此，絲素和絲膠蛋白的相對質量含量顯然要比其相對分子數(shù)含量所反映的數(shù)值更高，占各種蠶絲蛋白總質量的84.6％～96.7％。
　　2.絲腺腔和蠶絲中蛋白酶抑制劑的結構與活性分析
　　(1)絲腺腔內容物和蠶絲中蛋白酶抑制劑的結構分析:家蠶絲腺腔內容物和蠶絲中的蛋白酶抑制劑有51個，根據(jù)所含的不同結構域可以分為13類:Serpin、TIL、Kunitz_ BPTI、Kazal、amfpi、WAP、Pacifast

10、in、PBP、 A2M、 Inhibitor_ I29、Inhibitor_ I68、Cystatin和proteasome inhibitor。前9類屬于絲氨酸蛋白酶抑制劑，其中的6類（TIL、Kunitz BPTI、Kazal、amfpi、WAP和Pacifastin）屬于經(jīng)典類絲氨酸蛋白酶抑制劑，因為它們有類似的結構和抑制機制。經(jīng)典類絲氨酸蛋白酶抑制劑都富含半胱氨酸，能形成分子內的多對二硫鍵，具有異常穩(wěn)定的結構，并且也常常包含多個

11、串聯(lián)的結構域，使得抑制效率成倍地增加。
　　(2)絲腺腔內容物和蠶絲中蛋白酶抑制劑的活性分析:通過預測活性位點，發(fā)現(xiàn)絲腺分泌的蛋白酶抑制劑包括胰蛋白酶抑制劑、胰凝乳蛋白酶抑制劑、彈性蛋白酶抑制劑和枯草桿菌蛋白酶抑制劑等。具有串聯(lián)結構域的蛋白酶抑制劑由于有多個活性位點，因此具有抑制多種蛋白酶活性的潛力。利用5種商品化的蛋白酶作為靶酶，我們測定了蠶繭絲中蛋白酶抑制劑的活性和特異性，結果表明繭中存在大量的蛋白酶K抑制劑和少量的胰蛋白酶抑

12、制劑，但不存在或者存在微量的胰凝乳蛋白酶抑制劑、彈性蛋白酶抑制劑和半胱氨酸蛋白酶抑制劑。細菌和真菌等微生物都能分泌枯草桿菌蛋白酶（例如蛋白酶K）來消化宿主的蛋白質，從而攝取營養(yǎng)和入侵其它生物。因此，蠶繭絲中大量存在的蛋白酶K抑制劑可能起到防御微生物的作用。
　　(3)蠶絲中蛋白酶抑制劑的純化:利用制備的胰蛋白酶親和柱對提取的蠶繭絲蛋白進行親和層析，我們純化到兩個胰蛋白酶抑制劑，其分子量分別為15 kDa和13 kDa，因此將其命名

13、為TI15和TI13。質譜鑒定發(fā)現(xiàn)TI15是Kunitz家族的絲氨酸蛋白酶抑制劑BmSPI51，但無法鑒定出TI13。利用制備的蛋白酶K親和柱對提取的蠶繭絲蛋白進行親和層析，我們純化到一個分子量約30 kDa的蛋白酶K抑制劑，將其命名為KI30。雖然沒有得到可信的質譜鑒定結果，但是Western blot的結果顯示出BmSPI39抗體與KI30蛋白有明顯的雜交信號，表明KI30為TIL家族的絲氨酸蛋白酶抑制劑，可能為BmSPI39或者是

14、與其高度同源的蛋白。非標定量結果表明，BmSPI51和BmSPI39是蠶繭絲中含量最高的兩個蛋白酶抑制劑，暗示KI30是BmSPI39的可能性很高。BmSPI51和BmSPI39都屬于經(jīng)典類的絲氨酸蛋白酶抑制劑，之前的研究認為它們的作用是通過抑制蛋白酶的活性來保護繭絲，使其不被降解。
　　3.絲腺分泌的Serpin類絲氨酸蛋白酶抑制劑的表達譜分析、純化及活性測定
　　(1)絲氨酸蛋白酶抑制劑Serpin16的抗體特異性檢測:

15、Serpin16是絲腺中含量最高的Serpin類絲氨酸蛋白酶抑制劑。我們利用實驗室之前原核表達的Serpin16蛋白制備了多克隆抗體，通過結合雙向電泳、Western blot和MALDI-TOF-MS等技術驗證了此抗體的特異性。利用雙向電泳分離5齡第3天的絲腺總蛋白，再進行Western blot分析，發(fā)現(xiàn)Serpin16的抗體能夠雜交到兩個蛋白點，命名為spot1和spot2。利用MALDI-TOF-MS對這兩個蛋白點進行了鑒定，發(fā)

16、現(xiàn)spot1只包含了S erpin16特有的肽段，而spot2既包含了Serpin18特有的肽段也包含了Serpin22特有的肽段，表明S erpin16抗體能夠識別Serpin16、Serpin18和Serpin22三個蛋白。這是由于這三個蛋白的氨基酸序列同源性非常高而造成的。我們利用該抗體調查了S erpin16、Serpin18和Serpin22三個蛋白的表達特征。
　　(2) Serpin16、Serpin18和Serpi

17、n22的合成與分泌:半定量RT-PCR的結果表明家蠶Serpin16、Serpin18和Serpin2基因都在5齡第7天之前的家蠶中部絲腺前區(qū)表達。通過Western blot在蛋白水平也得到了類似的結果:Serpin16、Serpin18和Serpin22蛋白都存在于中部絲腺前區(qū)和前部絲腺中;Serpin16從5齡第1天到5齡第5天含量逐漸升高，之后含量降低;而Serpin18和Serpin22蛋白是從5齡初期到5齡第7天含量升高，之

18、后含量降低。Western blot和免疫熒光的結果表明它們主要分布于中部絲腺前區(qū)的腔內。綜合以上結果，我們發(fā)現(xiàn)S erpin16、Serpin18和Serpin22從5齡初期到中期由家蠶中部絲腺前區(qū)細胞合成，然后分泌到絲腺腔中，吐絲之前含量開始減少。
　　(3) Serpin16、Serpin18和Serpin22的純化與活性測定:通過綜合利用陰離子交換層析和凝膠過濾的方法，我們從5齡第5天家蠶的中部絲腺前區(qū)腔內容物中分離純化到

19、了Serpin16、Serpin18和Serpin22蛋白?；钚詼y定結果表明，它們對枯草桿菌蛋白酶、蛋白酶K和木瓜蛋白酶具有較強的抑制活性，而對胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶和彈性蛋白酶的抑制活性較低。由于這3個Serpin蛋白都存在于中部絲腺前區(qū)的腔內，因此我們對中部絲腺前區(qū)腔內的蛋白進行酶活測定，結果表明5齡第5天蛋白酶活性還很低，但是到5齡第7天蛋白酶活性顯著升高，而Serpin16、Serpin18和Serpin22表現(xiàn)出對5齡第7天中

20、部絲腺前區(qū)腔內蛋白酶活性的顯著抑制作用。綜合以上結果發(fā)現(xiàn)，在吐絲之前的5齡第7天，中部絲腺前區(qū)腔內蛋白酶的活性顯著升高，與此同時，它們的抑制劑Serpin16、Serpin18和Serpin22的含量顯著降低。我們推測Serpin16、Serpin18和Serpin22可能的作用是將其靶蛋白酶限制于特定時期的絲腺的特定部位。
　　4.絲腺分泌的Serpin類絲氨酸蛋白酶抑制劑與蛋白酶的相互作用
　　(1)絲氨酸蛋白酶BmSP

21、82的表達特征分析:非標定量的結果表明絲腺腔內的絲氨酸蛋白酶BmSP82在絲腺中的含量遠高于其它蛋白酶，且主要存在于中部絲腺前區(qū)，這與Serpin的表達特征類似，因此我們推測其是Serpin16、Serpin18和Serpin22的潛在靶酶。利用半定量RT-PCR技術，我們調查了BmSP82的表達特征，發(fā)現(xiàn)BmSP82只在馬氏管和絲腺中表達，將絲腺細分為5個區(qū)段后，發(fā)現(xiàn)BmSP82在中部絲腺前區(qū)的表達量很高，在絲腺的其它區(qū)段表達量較低，

22、與Serpin16、Serpin18和Serpin22的組織表達特征類似。時期表達譜結果表明，BmSP82在整個5齡期都有較高的表達量，在5齡第5天到5齡第7天期間表達量最高，與Serpin16、Serpin18和Serpin22的時期表達特征不同。
　　(2)絲氨酸蛋白酶BmSP82與Serpin16、Serpin18和Serpin22的相互作用:我們成功構建了BmSP82的重組表達質粒，轉化畢赤酵母后，利用含G418的平板篩選

23、到了多拷貝轉化子，利用甲醇誘導表達獲得了分泌到酵母細胞外的BmSP82蛋白。絲氨酸蛋白酶BmSP82酶原由N端的CUB結構域和C端的催化結構域兩部分組成。我們利用胰蛋白酶水解切割BmSP82酶原，使催化結構域與CUB結構域分離，從而激活成為成熟體酶。將成熟體酶與S erpin16、Serpin18和Serpin22蛋白進行孵育，然后通過Western blot方法檢測，發(fā)現(xiàn)BmSP82與Serpin16、Serpin18和Serpin2