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1、Kazal型蛋白酶抑制劑廣泛存在于生物體內(nèi),對機體的發(fā)育和免疫應(yīng)答等生理過程發(fā)揮極其重要的作用。該類抑制劑一般由一個或多個Kazal型結(jié)構(gòu)域組成,并且每個結(jié)構(gòu)域具有保守的序列結(jié)構(gòu)特征和三維構(gòu)像,通常認(rèn)為每個結(jié)構(gòu)域均能形成三對鏈內(nèi)二硫鍵且其抑制專一性取決于P1活性位點。本實驗室從中期蠶蛹中成功克隆到一個全長為1036 bp的基因序列(BmSPI),該序列為首次報道,在GenBank的登錄號為:DN236893,其ORF框為933 bp,編
2、碼310個氨基酸。將該推測的氨基酸序列進行同源性(BlastP)比對,發(fā)現(xiàn)該蛋白具有三個保守的Kazal型結(jié)構(gòu)域(C-X<,3>-C-X<,9>-C-X<,6>-Y-X<,7>-C-X<,3>-C-X<,11>-C)和三個不同的P1活性位點:蘇氨酸(T)、丙氨酸(A)、谷氨酰氨(Q),通過SignalP3.0分析發(fā)現(xiàn)該蛋白N末端不存在信號肽。通過PCR擴增目的基因完整的ORF框,經(jīng)過BamHI和XhoI雙酶切,將該基因重組到GST融合表
3、達(dá)載體pGEX-5X-1后轉(zhuǎn)化TG1中質(zhì)粒擴增,再轉(zhuǎn)化到BL21(DE3)star中進行表達(dá)分析。通過GST親和層析,得到較純的融合目的蛋白GST-BmSPI,F(xiàn)actor Xa因子將融合蛋白中的GST切除后,再通過反相快速液相色譜(RP-FPLC)進一步純化,質(zhì)譜鑒定該蛋白的分子量為33.642 kDa。對Thrombin、Subtilisin A、Chrymotrypsin體外酶抑制試驗表明BmSPI對Subtilisin有強烈的抑
4、制作用,進一步研究表明該蛋白與Subtilisin能形成摩爾比例為1:1的復(fù)合體且其抑制常數(shù)為3.35 nM。將經(jīng)過RP-FPLC純化的BmSPI作為抗原免疫新西蘭兔制備多克隆抗體,ELISA檢測該抗血清的效價達(dá)到1:106000以上。將爬片的Bm5細(xì)胞進行細(xì)胞免疫實驗,發(fā)現(xiàn)BmSPI表達(dá)在細(xì)胞質(zhì)中,而細(xì)胞核中幾乎沒有。取五齡家蠶做橫切冷凍切片,用Cy3標(biāo)記的羊抗兔二抗做免疫組織定位,發(fā)現(xiàn)該蛋白幾乎遍及各組織中,特別是表皮中含量最高。提
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