新型絲氨酸蛋白酶抑制劑基因的克隆、表達(dá)及功能鑒定.pdf

1、絲氨酸蛋白酶抑制劑是一類具有多種功能的同源蛋白，該類蛋白酶抑制劑能夠與胰蛋白酶、糜蛋白酶等絲氨酸蛋白酶的活性部位結(jié)合，抑制其蛋白水解活性或者阻止蛋白酶原激活生成蛋白酶。這類蛋白酶抑制劑幾乎存在于所有生物體中，在血液凝集、補(bǔ)體激活、纖維溶解、炎癥反應(yīng)和腫瘤抑制等生理過程中發(fā)揮著重要作用。本實(shí)驗(yàn)室利用宏基因組文庫技術(shù)構(gòu)建了廣西北部灣海洋微生物宏基因組文庫，利用直接測(cè)序的篩選策略，篩選得到了一個(gè)具有絲氨酸蛋白酶抑制劑活性的陽性克隆(pGXAG

2、59)，其中可能含有一個(gè)編碼新型絲氨酸蛋白酶抑制劑的基因，命名為spi1C(GenBank登錄號(hào)：JF815525)。
　　 應(yīng)用生物信息學(xué)軟件對(duì)spi1C進(jìn)行分析得到以下信息：spi1C由642個(gè)堿基對(duì)組成；目標(biāo)靶蛋白由214個(gè)氨基酸殘基組成，分子量約為24227.28Da，理論等電點(diǎn)為4.33;在DNA水平上，與目前GenBank數(shù)據(jù)庫中的其他基因沒有明顯的相似性和同源性；在氨基酸水平上，該目標(biāo)蛋白與來自Salinibact

3、errubberM8中的一種絲氨酸蛋白酶抑制劑蛋白一致性為38％，相似性為59％。
　　 利用PCR定點(diǎn)技術(shù)擴(kuò)增目標(biāo)ORF，并與表達(dá)載體pETBlue-2連接，導(dǎo)入宿主細(xì)胞Escherichia.ColiBL21(DE3)pLysS，得到菌株BL21(DE3)pLysS/pGXAG59G。在本研究中以從該菌株中獲得的重組表達(dá)蛋白Spi1C作為主要研究對(duì)象，對(duì)其蛋白活性進(jìn)行了初步研究。通過SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測(cè)，在28kD

4、a處有明顯的表達(dá)條帶，與預(yù)測(cè)結(jié)果相符。使用鎳柱純化重組蛋白，應(yīng)用BAEE和ATEE作為生色底物對(duì)重組蛋白Spi1C的蛋白活性進(jìn)行測(cè)定。該抑制劑蛋白的最適PH值為7.0～8.0，最適反應(yīng)溫度為25℃，其變性溫度為65℃。在最適條件下，Spi1C對(duì)于胰蛋白酶的抑制比活為6941U/mg，對(duì)于α-糜蛋白酶的抑制比活為3637U/mg。采用Lineweaver-Burk作圖法，測(cè)得Spi1C對(duì)于胰蛋白酶的抑制常數(shù)Ki值為1.52×10-8M，S