蛋白酶體抑制劑對(duì)自然殺傷細(xì)胞活性和功能影響的研究.pdf

1、泛素-蛋白酶體（Ubiquitin-proteasome pathway，UPP）是哺乳動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)主要的蛋白水解酶體系，參與和調(diào)控細(xì)胞的增殖、分化和凋亡。蛋白酶體主要由20S催化顆粒和19S調(diào)節(jié)顆粒兩部分組成，其活性狀態(tài)對(duì)維持細(xì)胞的正常功能起重要作用。蛋白酶體抑制劑可通過(guò)抑制蛋白酶體活性進(jìn)而干擾和影響細(xì)胞功能，尤其對(duì)腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)有明顯的抑制作用。蛋白酶體抑制劑硼替佐米（bortezomib，velcade）是近年研究較多的一種蛋白酶體抑

2、制劑，目前已被較廣泛地應(yīng)用于多種惡性腫瘤特別是多發(fā)性骨髓瘤的治療。除了直接誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡外，硼替佐米尚可提高腫瘤細(xì)胞對(duì)自然殺傷（natural killer，NK）細(xì)胞殺傷的敏感性。然而，近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)硼替佐米對(duì)免疫細(xì)胞如T細(xì)胞和樹突細(xì)胞有一定的毒性作用，如誘導(dǎo)活化的T細(xì)胞凋亡，抑制樹突細(xì)胞活化T細(xì)胞的功能等。NK細(xì)胞是先天免疫細(xì)胞，在抗感染和抗腫瘤免疫中起著致關(guān)重要的作用。目前，有關(guān)硼替佐米對(duì)NK細(xì)胞功能調(diào)節(jié)作用的研究甚少。

3、 目的：研究蛋白酶體抑制劑硼替佐米對(duì)正常人外周血NK細(xì)胞活性和功能的影響，探討硼替佐米誘導(dǎo)NK細(xì)胞凋亡機(jī)制；觀察聯(lián)合應(yīng)用硼替佐米與IL-12對(duì)多發(fā)性骨髓瘤SCID鼠皮下移植瘤生長(zhǎng)及體內(nèi)NK細(xì)胞殺傷活性的影響，研究IL-12與硼替佐米協(xié)同抗腫瘤作用以及IL-12抵抗硼替佐米對(duì)NK細(xì)胞的毒性作用。 方法: 1.體外研究硼替佐米對(duì)人外周血自然殺傷細(xì)胞活性和功能的影響 1.1硼替佐米對(duì)人外周血淋巴細(xì)胞或LAK細(xì)胞活性的影

4、響：采用淋巴細(xì)胞分離液分離正常人外周血單個(gè)核細(xì)胞，去除貼壁細(xì)胞后獲取懸浮細(xì)胞即外周血淋巴細(xì)胞（PBLs）。體外應(yīng)用白介素-2（IL-2）誘導(dǎo)PBLs72h產(chǎn)生淋巴因子激活的殺傷（LAK）細(xì)胞。將PBLs、LAK細(xì)胞進(jìn)行體外培養(yǎng)，給予不同濃度的硼替佐米處理12、24、48h，采用AnnexinⅤ（AV）和propidium iodide（PI）雙標(biāo)進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況。 1.2硼替佐米對(duì)人外周血自然殺傷細(xì)胞活性和功能的影

5、響：采用NK細(xì)胞陰性選擇試劑盒分離純化正常人NK細(xì)胞，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)NK純度，將NK細(xì)胞進(jìn)行體外培養(yǎng)，給予不同濃度的硼替佐米處理12、24h，或聯(lián)合應(yīng)用GSH（氧自由基清除劑）或zVAD（全Caspase抑制劑）預(yù)處理，AV和PI雙標(biāo)進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡；熒光測(cè)定半胱天冬酶caspase-3活性的變化；Mitotracker Red熒光染色法測(cè)定線粒體膜電位的改變；細(xì)胞內(nèi)染色法檢測(cè)穿孔素的表達(dá)；細(xì)胞表面染色檢測(cè)NK細(xì)胞膜活化性受體

6、的表達(dá)；分別以K562細(xì)胞和P815細(xì)胞作為靶細(xì)胞采用標(biāo)準(zhǔn)的4h51Cr釋放試驗(yàn)檢測(cè)NK細(xì)胞的細(xì)胞毒作用或殺傷功能。 2.硼替佐米對(duì)骨髓瘤小鼠自然殺傷細(xì)胞活性和功能的影響 2.1建立SCID鼠多發(fā)性骨髓瘤皮下移植瘤模型：對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的RPMI8226細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞數(shù)至1×108/ml，取0.1 ml含107個(gè)細(xì)胞接種于5-6周齡雌性SCID鼠前肢處背部皮下。14d后實(shí)體瘤長(zhǎng)至直徑大于0.5cm時(shí)進(jìn)行藥物干預(yù)。 2.

7、2荷瘤小鼠體內(nèi)注射NS、硼替佐米和/或IL-12抑瘤效果觀察、NK細(xì)胞數(shù)變化及脾細(xì)胞殺傷功能SCID鼠皮下成瘤后隨機(jī)分成NS組、IL-12組（0.4ug/只）、硼替佐米組（0.75mg/kg）和硼替佐米+IL-12序貫治療組，分別給予腹腔注射IL-12，尾靜脈注射硼替佐米和NS，觀察荷瘤小鼠瘤體的生長(zhǎng)抑制情況；干預(yù)前后取外周血做血常規(guī)及流式檢測(cè)NK細(xì)胞比例，末期取脾細(xì)胞懸液做LDH釋放實(shí)驗(yàn)檢測(cè)NK細(xì)胞的殺傷功能。 結(jié)論: