家蠶絲腺特異高量表達(dá)絲氨酸蛋白酶抑制劑的研究.pdf

1、家蠶絲腺是合成絲蛋白的重要器官，家蠶絲腺中的絲氨酸蛋白酶抑制劑是一類重要的蛋白酶抑制劑，有研究報道其可能和家蠶絲蛋白的合成和保護(hù)有關(guān)。要闡明家蠶絲蛋白高效特異合成的機(jī)理，家蠶絲腺中絲氨酸蛋白酶抑制劑的調(diào)控作用是關(guān)鍵問題之一，但目前其相關(guān)研究報道還較少。2003年本實(shí)驗(yàn)室成功繪制了家蠶基因組框架圖，2006年完成了家蠶全基因組的寡核苷酸芯片的研制以及從基因水平、表達(dá)水平和蛋白質(zhì)水平建立了功能基因組研究平臺，為我們系統(tǒng)分析家蠶絲腺絲氨酸蛋白

2、酶抑制劑的種類、結(jié)構(gòu)特征和進(jìn)化關(guān)系提供了研究基礎(chǔ)和技術(shù)保障。本研究首先利用蛋白質(zhì)研究方法對家蠶絲腺中的胰蛋白酶抑制劑多態(tài)性進(jìn)行了調(diào)查，然后利用分子生物學(xué)和生物信息學(xué)方法對家蠶絲腺中的絲氨酸蛋白酶抑制劑進(jìn)行了全基因組數(shù)據(jù)鑒定，對其中重要的抑制劑基因進(jìn)行了克隆和原核表達(dá)。主要結(jié)果如下： 1．家蠶絲腺中絲氨酸蛋白酶抑制劑的多態(tài)性調(diào)查利用非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳(Native—PAGE)和胰蛋白酶抑制劑(TI)活性染色方法對25個家蠶品

3、系絲腺的胰蛋白酶抑制劑的多態(tài)性分布進(jìn)行了調(diào)查，電泳圖譜分析表明在家蠶絲腺中共檢測到6種TIs，按遷移度分別命名為：TI—Ⅰ、TI—Ⅱ、TI—Ⅲ、TI—Ⅳ、TI—Ⅴ和TT—Ⅵ，不同品系中所含的TI種類不同。以家蠶大造為例，我們對同一品系不同組織器官中的TI類型進(jìn)行調(diào)查發(fā)現(xiàn)，TI在組織間存在多態(tài)性，絲腺中的TI種類與其它組織含有的TI種類不同，具有特異性。以家蠶品系大造和21-872為例，對不同品系5齡不同發(fā)育時期絲腺的TI種類進(jìn)行調(diào)查發(fā)現(xiàn)

4、，品系不同，TI種類不同；而不同的TI種類其活性檢測到的發(fā)育時期不同，但所有TI種類的活性都隨著發(fā)育時期的進(jìn)行而逐漸增強(qiáng)，吐絲第2天達(dá)到最大，后慢慢降低，蛹第1天時幾乎檢測不到活性。 2．家蠶繭殼中絲氨酸蛋白酶抑制劑的理化性質(zhì)初探利用Native—PAGE和TI活性染色方法，我們對家蠶陳舊繭殼中的TI活性進(jìn)行了調(diào)查，發(fā)現(xiàn)家蠶陳舊繭殼中的TI活性較新鮮繭殼相對降低，個別TI種類活性甚至消失。利用不同pH和溫度處理家蠶繭殼發(fā)現(xiàn)，TI

5、種類不同，其對酸堿和溫度的穩(wěn)定性不同，其中TI—Ⅵ對pH和溫度最穩(wěn)定。 3．家蠶絲腺絲氨酸蛋白酶抑制劑的種類、結(jié)構(gòu)特征和進(jìn)化關(guān)系利用家蠶全基因組數(shù)據(jù)、基因芯片和EST數(shù)據(jù)，對家蠶絲腺中的絲氨酸蛋白酶抑制劑進(jìn)行了全基因組數(shù)據(jù)鑒定，在家蠶絲腺中共鑒定了14種絲氨酸蛋白酶抑制劑特異高量表達(dá)，分別命名為：BmSPIs1～BmSPIs14，都有EST證據(jù)。利用NCBI中的BIAST工具和結(jié)構(gòu)預(yù)測工具SMART對這14種絲氨酸蛋白酶抑制劑的

6、結(jié)構(gòu)進(jìn)行了預(yù)測，結(jié)果顯示BmSPIs3、BmSPIs4、BmSPIs5、BmSPIs6、BmSPIs7和BmSPIs8具有Serpin型結(jié)構(gòu)域；BmSPIs1、BmSPIs2和BmSPIs9具有TIL結(jié)構(gòu)域；BmSPIs12、BmSPIs13和BmSPIs14屬于Kunitz型結(jié)構(gòu)域；BmSPIs11屬于Kaza1型結(jié)構(gòu)域；而BmSPIs10既有Serpin又有TIL結(jié)構(gòu)域。采用ClustalW程序和MEGA程序中的鄰接法對這14種絲氨

7、酸蛋白酶抑制劑與其它物種中的絲氨酸蛋白酶抑制劑構(gòu)建進(jìn)化樹發(fā)現(xiàn)，相同結(jié)構(gòu)域的抑制劑首先聚在一起，說明家蠶絲腺特異高量表達(dá)的這四種結(jié)構(gòu)域的絲氨酸蛋白酶抑制劑在物種間是比較保守的。 4．家蠶絲腺絲氨酸蛋白酶抑制劑的克隆和原核表達(dá)利用RT—PCR技術(shù)，我們對家蠶絲腺特異高量表達(dá)的BmSPIs5、BmSPIs6、BmSPIs8、BmSPIs13和BmSPIs14五種抑制劑進(jìn)行了組織表達(dá)譜驗(yàn)證，進(jìn)一步對這5個基因進(jìn)行了TA克隆，獲得了完整的