煙草Kunitz型胰蛋白酶抑制劑基因的分離及功能鑒定.pdf

1、植物病害是世界范圍內(nèi)影響作物產(chǎn)量的最嚴重的生物脅迫之一，嚴重影響了作物產(chǎn)量和品質(zhì)。而80％的作物病害是由病原真菌引起的。立枯絲核菌(Rhizoctonia solani)是半知菌亞門絲核菌屬的一個種，為死體營養(yǎng)菌，分布廣、寄主范圍大，常以菌核形態(tài)習居土壤，是小麥、玉米、水稻等禾本科作物紋枯病，草坪草褐斑病，馬鈴薯、棉花、大豆、煙草立枯病的致病菌。雖然該病研究多年，但研究進展較少，主要進展也僅僅集中在生物防治領域。在植物抗病基因工程中，通

2、過將抗真菌蛋白基因轉入植物來提高農(nóng)作物對真菌病害的抗性已成為一種直接有效的方法，并且在一些重要作物改良中取得了一定進展。 本研究通過構建真菌誘導煙草幼苗cDNA文庫，并用反向Northern差異篩選法獲得一個與生物脅迫相關的Kunitz型蛋白酶抑制劑基因NtKTI1。本研究對NtKTI1基因序列、表達及生物學功能進行了重點分析，主要研究結果如下： 1、利用Clontech SmartTM cDNA Library Con

3、struction Kit構建真菌誘導煙草cDNA文庫，通過反向Northern差異篩選法分離獲得一個長563bp的cDNA片斷。應用RACE技術得到這個基因的全長，命名為NtKTI1。該基因全長840bp，編碼區(qū)長627bp。估計分子量為23.1kDa，等電點為9.36。該基因在GenBank中的注冊號為FJ494920。 2、同源比對分析表明NtKTI1與非洲奇果蛋白、植物Kunitz型蛋白酶抑制劑等蛋白具有很高的同源性，分

4、子內(nèi)有兩對二硫鍵和一個活性中心。使用JPred，SWISSMODEL，CPHmodels和ESyPred3D等蛋白質(zhì)二級、三級結構數(shù)據(jù)庫在線分析表明NtKTI1與KTI3具有類似的三維結構。隨后使用Swiss-Model和RasMol構建了NtKTI1的三維模型。 3、采用生物信息學的手段在擬南芥和水稻基因組數(shù)據(jù)庫中搜尋NtKTI1的同源基因，從擬南芥中找到7個，水稻中僅找到1個。聚類分析表明NtKTI1與AtIg17860，A

5、tIg73260，Os04g0526600聚到一個進化枝上。 4、RT-PCR及Northern表達分析表明NtKTI1在根和莖中表達量最高，其次是花和葉中，在種子中的表達量很低。在尼R.solani，SA和傷處理時，NtKTI1在一定的時間范圍內(nèi)其表達水平隨誘導時間的延長而降低，但不受MeJA，ABA和NaCl處理的影響。由PRIc的表達模式推測煙草在立枯絲核菌侵染時的信號轉導模式類似于傷信號是依賴SA的信號轉導。 5

6、、使用hiTAIL-PCR的方法擴增得到NtKTI1長為1471bp的調(diào)控序列，PlantCare預測出多個逆境脅迫響應元件。 6、構建原核表達載體誘導純化得到缺失信號肽序列而帶有組氨酸標簽的NtKTI1融合蛋白。酶活測定結果表明該融合蛋白具有胰蛋白酶抑制劑活性。抑菌圈試驗結果表明該融合蛋白對立枯絲核菌具有很強的抑菌活性，對桃根霉、煙草疫霉的抑菌活性較弱，但對細菌如E.Coli沒有作用。 7、構建NtKTI1的植物正義反