一個(gè)水稻莖葉優(yōu)勢(shì)表達(dá)鋅指基因啟動(dòng)子的克隆及功能分析.pdf

1、基因表達(dá)與否以及表達(dá)時(shí)間、表達(dá)部位需要啟動(dòng)子的順式作用元件與相應(yīng)的轉(zhuǎn)錄因子協(xié)同作用。根據(jù)需要選擇或人工構(gòu)建合適的啟動(dòng)子(組成型、組織器官特異性、誘導(dǎo)型或復(fù)合型啟動(dòng)子)，可以研究新基因的功能，闡明植物的生長(zhǎng)、發(fā)育、分化及繁殖過程與機(jī)理，還可以在植物特定的部位或發(fā)育階段生產(chǎn)有用蛋白質(zhì)或其他代謝產(chǎn)物，實(shí)現(xiàn)對(duì)外源基因表達(dá)的定時(shí)、定點(diǎn)、定量的精確調(diào)控。水稻莖葉特異性啟動(dòng)子是只在水稻莖和葉等營(yíng)養(yǎng)器官中表達(dá)，而不在生殖器官和種子食用部位表達(dá)的特殊啟動(dòng)

2、子，對(duì)這類啟動(dòng)子的研究和應(yīng)用，不僅有助于闡釋相關(guān)基因的生物學(xué)功能，而且在基因工程中使用此類啟動(dòng)子將有助于消除人們對(duì)轉(zhuǎn)基因水稻食品安全性的擔(dān)心。 本實(shí)驗(yàn)室利用RT-PCR技術(shù)分析了354個(gè)水稻鋅指基因在水稻授粉受精后的根、莖、葉及種子不同發(fā)育階段的表達(dá)情況，獲得了170個(gè)水稻鋅指基因的表達(dá)特征，鑒定出一批可能在水稻不同器官或種子不同發(fā)育階段特異性表達(dá)的鋅指基因。本研究選擇了1個(gè)水稻鋅指基因ZF153開展研究。其主要結(jié)果如下：

3、 1、利用RT-PCR技術(shù)分析ZF153鋅指基因在水稻不同發(fā)育時(shí)期、不同器官的表達(dá)特征。研究結(jié)果表明，ZF153基因只在水稻的莖、葉中表達(dá)，在根、花及種子發(fā)育的前期、中期、后期都沒有表達(dá)。該結(jié)果暗示ZF153基因是一個(gè)在莖葉中特異表達(dá)的鋅指基因。 2、利用PCR擴(kuò)增了ZF153鋅指基因及其上游啟動(dòng)子區(qū)域，并分別克隆于T載體及pBlueks，測(cè)序后在NCBI上進(jìn)行序列比對(duì)的結(jié)果表明，我們克隆的ZF153鋅指基因及其上游啟動(dòng)子區(qū)域

4、的序列完全正確。應(yīng)用PLACE預(yù)測(cè)分析了ZF153鋅指基因上游啟動(dòng)子區(qū)域序列，發(fā)現(xiàn)其中含有大多數(shù)高等植物啟動(dòng)子的保守元件，說(shuō)明它具有潛在的啟動(dòng)子活性；同時(shí)，其中具有多個(gè)特異性調(diào)控元件，如YACT一葉肉細(xì)胞特異表達(dá)的順式元件，暗示出該序列對(duì)基因的表達(dá)調(diào)控具有一定的特異性。 3、分別構(gòu)建了鋅指基因ZF153啟動(dòng)子與GUS的融合表達(dá)載體pC153P-GUS及ZF153的cDNA正義和反義表達(dá)載體pCA153gS和pCA153gA。通過

5、農(nóng)桿菌介導(dǎo)法，已經(jīng)獲得了pC153P-GUS和部分pCA153gS的再生植株。pC153P-GUS轉(zhuǎn)基因T<,0>代植株GUS活性分析顯示：在pC153P-GUS轉(zhuǎn)基因T<,0>代植株的根、莖、葉、穎殼中檢測(cè)到GUS活性，其中莖和葉中GUS活性表現(xiàn)較強(qiáng)，而根和穎殼中表現(xiàn)較弱，在雄蕊和雌蕊及種子不同發(fā)育階段中沒有檢測(cè)到GUS活性，表明ZF153啟動(dòng)子可能是一個(gè)水稻非生殖器官表達(dá)，且在莖、葉中優(yōu)勢(shì)表達(dá)啟動(dòng)子。研究結(jié)果暗示了ZF153基因可能