胸膜肺炎放線桿菌Ⅳ型菌毛結(jié)構(gòu)蛋白ApfA功能及免疫原性研究.pdf

1、豬傳染性胸膜肺炎是由胸膜肺炎放線桿菌(Actinobacilluspleuropneumoniae，APP)引起的一種高度傳染性呼吸道疾病，給世界各地的養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。APP通過飛沫傳播或感染動物接觸傳播，定植于豬下呼吸道表皮細(xì)胞。APP血清型眾多，根據(jù)表面多糖抗原性差異可將該病原分為15個血清型。胸膜肺炎放線桿菌在不同國家和地區(qū)的流行情況具有一定差異，我國已分離到APP血清1、2、3、4、5、7和8型菌株，其中以7型最多，

2、其次為1型、2型和3型。
　　 APP致病過程涉及眾多毒力因子，目前圍繞其致病機(jī)制開展了大量研究工作，然而APP早期定植感染的致病機(jī)理尚不明確。Ⅳ型菌毛在多種病原菌致病過程中發(fā)揮重要作用，其中包括介導(dǎo)粘附定植、突破免疫屏障、影響生物被膜形成、顫搐運(yùn)動、DNA攝取等。為了更好地控制和預(yù)防APP導(dǎo)致的疾病，研究APP致病機(jī)理，尤其是APP早期粘附定植的作用機(jī)制具有重要意義。本課題對APPⅣ型菌毛的功能和在致病過程發(fā)揮的作用進(jìn)行探討，

3、并對Ⅳ型菌毛結(jié)構(gòu)蛋白ApfA的免疫原性與免疫保護(hù)力進(jìn)行了研究。
　　 1.胸膜肺炎放線桿菌Ⅳ型菌毛介導(dǎo)粘附和定植
　　 粘附是細(xì)菌建立感染的第一步，在致病過程中起著決定性作用。因此本課題對APPⅣ型菌毛是否參與APP宿主粘附定植過程進(jìn)行研究，研究結(jié)果如下:首先，通過熒光定量PCR的方法對APP與豬肺上皮細(xì)胞(SJPLC)互作后Ⅳ型菌毛操縱子基因表達(dá)水平進(jìn)行檢測，發(fā)現(xiàn)與細(xì)胞互作后apf操縱子整體表達(dá)水平顯著上升。其次，本研

4、究構(gòu)建了Ⅳ型菌毛結(jié)構(gòu)蛋白基因缺失突變株4074△apfA，以及互補(bǔ)菌株C4074△apfA。以豬髖動脈內(nèi)皮細(xì)胞(PIEC)和SJPLC為粘附模型，通過粘附和粘附抑制實(shí)驗(yàn)共同證明Ⅳ型菌毛在APP粘附宿主細(xì)胞的過程中發(fā)揮作用。同時，通過共聚焦顯微鏡對粘附結(jié)果進(jìn)行觀察，發(fā)現(xiàn)4074△aPfA基因缺失突變株粘附能力顯著減弱，而互補(bǔ)菌株與野生株粘附能力相當(dāng)，再次證明Ⅳ型菌毛參與粘附過程。最后，在小鼠活體感染模型中證明Ⅳ型菌毛在APP肺部定植過程中

5、發(fā)揮重要作用，并影響APP致病力。以上結(jié)果表明APPⅣ型菌毛是細(xì)胞接觸誘導(dǎo)表達(dá)型，參與了APP定植感染過程，在致病過程中發(fā)揮重要作用。
　　 2.胸膜肺炎放線桿菌Ⅳ型菌毛負(fù)調(diào)控生物被膜的形成
　　 Ⅳ型菌毛參與粘附外的多種致病機(jī)制，本研究對APPⅣ型菌毛可能參與的其他致病機(jī)制進(jìn)行探討。為了研究Ⅳ型菌毛是否與APP生物被膜形成調(diào)控相關(guān)，我們通過結(jié)晶紫染色方法對野生菌株和4074△aPfA基因缺失突變株的生物被膜形成能力進(jìn)行

6、定量比較，結(jié)果發(fā)現(xiàn)4074△aPfA基因缺失突變株生物被膜形成能力顯著增強(qiáng)。該結(jié)果表明Ⅳ型菌毛負(fù)調(diào)控APP生物被膜的形成，我們推測Ⅳ型菌毛可能參與了群體感應(yīng)調(diào)節(jié)因子LuxS對于生物被膜形成的負(fù)調(diào)控過程。此外，我們還對比了野生菌株和4074Δqpf4基因缺失突變株溶血活性和細(xì)胞毒性的差異，結(jié)果發(fā)現(xiàn)Ⅳ型菌毛的缺失不影響APP溶血毒素和細(xì)胞毒素的分泌。
　　 3.胸膜肺炎放線桿菌Ⅳ型菌毛潛在受體的尋找
　　 以上研究證明了Ⅳ型

7、菌毛主要是通過介導(dǎo)細(xì)胞粘附在APP早期感染過程中發(fā)揮重要作用。在奈瑟球菌屬中，Ⅳ型菌毛的已知細(xì)胞粘附受體是CD46分子，為了驗(yàn)證CD46分子是否為APPⅣ型菌毛的特異性受體，我們進(jìn)行了以下研究:首先，構(gòu)建pcDNA-CD46真核表達(dá)質(zhì)粒并轉(zhuǎn)染幼倉鼠腎傳代細(xì)胞(BHK)(CD46分子陰性細(xì)胞)，通過流式細(xì)胞術(shù)檢測轉(zhuǎn)染效率，證明CD46分子在BHK細(xì)胞中表達(dá)。通過粘附實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，CD46分子的表達(dá)并沒有顯著提高APP對細(xì)胞的粘附效率。其次，用

8、CD46抗體處理SJPLC和PIEC細(xì)胞(CD46分子陽性細(xì)胞)，進(jìn)行粘附抑制實(shí)驗(yàn)，結(jié)果顯示CD46分子抗體封閉不影響APP對細(xì)胞的粘附作用。因此，上述結(jié)果證明CD46并非APP特異性粘附受體。
　　 為了進(jìn)一步尋找Ⅳ型菌毛的可能性受體，我們通過酵母雙雜交的方法來進(jìn)行研究:構(gòu)建pGBKT7-apfA作為誘餌載體，轉(zhuǎn)化酵母Y187菌株后與豬肺部cDNA酵母文庫進(jìn)行雜交，經(jīng)過三輪篩選獲得4個陽性克隆。對陽性克隆進(jìn)行測序并分析，結(jié)果發(fā)

9、現(xiàn)其中一個可能是Ⅳ型菌毛互作受體蛋白。該蛋白與豬Talin1蛋白同源，是一種細(xì)胞骨架蛋白，其與APPⅣ型菌毛的互作關(guān)系還有待進(jìn)一步的驗(yàn)證。
　　 4.胸膜肺炎放線桿菌Ⅳ型菌毛結(jié)構(gòu)蛋白ApfA是良好的保護(hù)性抗原
　　 本研究對Ⅳ型菌毛基因簇在APP13個血清型中的分布情況和同源性進(jìn)行比較分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)編碼apfA基因的結(jié)構(gòu)蛋白在12個血清型中高度保守;Ⅳ型菌毛基因簇在11個血清型中高度保守。為了檢測Ⅳ型菌毛結(jié)構(gòu)蛋白ApfA

10、的免疫原性，我們首先表達(dá)純化了重組ApfA(rApfA)蛋白，然后用純化的rApfA免疫小鼠，發(fā)現(xiàn)能夠誘發(fā)小鼠產(chǎn)生免疫應(yīng)答，產(chǎn)生較高抗體水平。其次，我們用rApfA-ELISA對豬APP感染血清和陰性血清中anti-ApfA抗體水平進(jìn)行檢測，發(fā)現(xiàn)感染血清中的抗體水平顯著高于陰性血清。以上結(jié)果說明Ⅳ型菌毛結(jié)構(gòu)蛋白ApfA不僅存在于所有血清型中，序列高度保守，并且具有很強(qiáng)的免疫原性。
　　 以上研究發(fā)現(xiàn)APPⅣ型菌毛結(jié)構(gòu)蛋白ApfA

11、具有較好的免疫原性并且高度保守，有可能發(fā)展成為是良好的保護(hù)性抗原。因此，我們接下來對菌毛結(jié)構(gòu)蛋白ApfA能否提供有效的免疫保護(hù)力進(jìn)行評估。首先，通過rApfA主動免疫小鼠后感染致死劑量APP，發(fā)現(xiàn)該抗原能夠?qū)PP血清1型4074菌株感染提供90％的保護(hù)，對APP血清7型WF83菌株感染提供80％的保護(hù)。其次，對免疫血清中anti-rApfA抗體進(jìn)行分型，發(fā)現(xiàn)rApfA能夠誘導(dǎo)Th2型主導(dǎo)的免疫反應(yīng)。用rApfA免疫血清通過靜脈注射被動