胸膜肺炎放線桿菌ΔapxⅠC-ΔapxⅡC雙基因缺失株的構建及其生物學特性和免疫原性的研究.pdf

1、豬傳染性胸膜肺炎(PCP)是由胸膜肺炎放線桿菌(APP)引起的豬的一種高度接觸傳染性呼吸道疾病，給世界各地的養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟損失。 預防和控制該病的主要措施是利用本地主要流行的血清型進行免疫接種。目前商品化的全菌滅活疫苗和亞單位疫苗能夠減輕同源血清型菌引起的臨床癥狀并降低死亡率，但不能降低發(fā)病率、慢性感染和阻止肺部病變，對異源血清型菌的感染也不能提供完全的交叉保護?？梢哉f，采用滅活苗和亞單位疫苗免疫不是最好的選擇，迫切需要

2、更安全、高效的新型疫苗來預防和控制該傳染病的發(fā)生與流行。與滅活疫苗和亞單位疫苗不同，APP的自然感染或試驗感染能夠誘導抗任何異源血清型的保護。而且弱毒活疫苗與傳統(tǒng)疫苗相比有能夠重復提呈抗原和持續(xù)性刺激免疫應答的優(yōu)點。因此通過缺失毒力因子構建弱毒活疫苗已成為國內(nèi)外疫苗研究的熱點。構建APP突變株的傳統(tǒng)方法存在很多缺陷。利用化學或轉座子介導的突變方法存在隨機性，遺傳背景不明晰；而通過傳統(tǒng)的同源重組方法導致靶基因突變而獲得的突變株最后含有抗性

3、標記，由于不符合生物安全性要求不能作為疫苗株用于疫苗生產(chǎn)。 鑒于上述背景，本研究旨在以本地分離APP-1型菌株SLW01為親本菌，缺失ApxI和ApxII的激活因子apxIC和apxIIC，構建不含抗性標記的APP雙基因缺失株，從而發(fā)展一個能提供有效的交叉保護效率的無外源基因的安全、廉價的APP弱毒活疫苗菌株來預防和控制豬傳染性胸膜肺炎的發(fā)生與流行，主要的研究內(nèi)容包括： 1．基因的克隆與重組自殺性質粒的構建 參照

4、GenBank中apxI apxlI基因的序列，從SLW01中擴增了apxlC和apxlIC基因的上下游片段。將得到的上下游片段，連接到攜帶蔗糖敏感基因(SacB)的自殺性質粒pEMOC2上，構建缺失了385 bp的apxlC基因的重組自殺性質粒pEMAIC和缺失了340 bp的apxIIC基因的重組自殺性質粒pEMAIIC。 2．接合轉移與缺失株SLW02、SLW03的篩選鑒定 以轉化了重組自殺性質粒pEMAIC的大腸

5、桿菌β2155為供體菌，APP-1型菌株SLW01為受體菌進行接合轉移。涂布氯霉素(Cm)抗性平皿并轉印到含10％蔗糖的平皿上，篩選Cm抗性(Cm<'R>)蔗糖敏感(Sur<'s>)的接合子，進一步用PCR鑒定重組自殺性質粒已經(jīng)整合到染色體中。鑒定正確的接合子在不含NaC1的培養(yǎng)基中培養(yǎng)促使第二次同源重組的發(fā)生。涂布含10％蔗糖的平皿，并轉印到Cm平皿上，篩選出Cm敏感(Cm<'s>)蔗糖抗性(Sur<'R>)的克隆，用進行PCR鑒定，

6、以確定發(fā)生了第二次交換，重組自殺性質粒已經(jīng)丟失。從而構建單基因缺失株SLW02。在單基因缺失株SLW02(AapxIC)的基礎上，用轉化了質粒pEMAIIC的大腸桿菌β2155作為供體菌，單基因缺失株SLW02(AapxIC)作為受體菌進行接合轉移，用同樣的方法構建雙基因缺失株SLW03(△apxlC/△apxIIC)。 3．缺失株生物學特性的研究 在綿羊血平皿上測定SLW01、SLW02和SLW03的溶血活性，結果顯示

7、SLW01具有極強的溶血活性，單基因缺失株SLW02(△apxIC)具有較弱的溶血活性，而雙基因缺失株SLW03(△apxIC/AapxlIC)則失去了溶血活性。 用Western blot檢測雙缺失株SLW03和親本菌SLW01中毒素的分泌情況，結果表明SLW01和SLW03都能夠分泌毒素Ⅰ和毒素Ⅱ，說明apxIC和apxIIC基因缺失后，SLW03仍然可以分泌無毒力的毒素。 將缺失株和親本株都進行活菌計數(shù)，繪制生長曲

8、線，結果表明，缺失株SLW02和SLW03與親本菌比較，生長速度沒有明顯的變化，說明apxIC和apxIIC的缺失對SLW01的生長無影響。 測定親本菌和缺失菌在Balb/C小鼠體內(nèi)的毒力，計算LD<,50>的值。結果顯示，與親本菌SLW01比較，單基因缺失株SLW02(△apxIC)的毒力降低了約200倍，雙基因缺失株SLW03(△apxIC/△apxIIC)的毒力降低了約2000倍。 4．雙基因缺失株SLW03(△a

9、pxlC/△apxIIC)對小鼠的免疫試驗及攻毒保護試驗 將SLW03和1、2、7型三價滅活疫苗分別免疫Balb/C雌鼠，免疫2次，間隔2周。于免疫前、一免后2周和二免后2周分別檢測了APP-1 IHA抗體和毒素ELISA抗體水平。結果表明，未免疫組的小鼠在整個試驗過程血清抗體均呈陰性。結果顯示，SLW03免疫小鼠后不但能夠刺激機體產(chǎn)生較高的菌體抗體，而且能夠產(chǎn)生較高的毒素抗體。滅活苗免疫組只能產(chǎn)生IHA抗體，不能產(chǎn)生毒素抗體。

10、二免兩周后，分別用低劑量(10 LD<,50>)和高劑量(100 LD<,50>)的同源血清型1型(SLW01)和異源血清型7型(XFNZ)攻毒。對于低劑量的攻毒，SLW03免疫組和滅活疫苗免疫組的小鼠都得到了100％的保護。對于高劑量的攻毒，SLW03對1型的保護率是100％，7型是75％。而滅活疫苗免疫組對1型和7型的高劑量的攻毒的保護率分別為25％和37．5％。所以弱毒菌株SLW03在小鼠中的免疫效力優(yōu)于傳統(tǒng)滅活疫苗。 5

11、．SLW03(△apxIC/△apxIIC)對斷奶仔豬的免疫試驗及攻毒保護試驗 將SLW03分別通過肌肉免疫和鼻內(nèi)免疫兩種途徑免疫斷奶仔豬，免疫2次，間隔2周。于免疫前、一免后2周和二免后2周分別檢測了APP-1：IHA抗體和毒素ELISA抗體水平。結果表明，兩個免疫組的IHA抗體和ELISA抗體都顯著高于對照組。但第28天，鼻內(nèi)免疫組的ELISA抗體水平顯著高于肌肉免疫組。二免兩周后分別用同源血清型(1型)和異源血清型(9型)