牛支原體免疫原性研究.pdf

1、牛支原體(Mycoplasma bovis)是感染牛的一種重要的致病性病原體，主要引起牛的肺炎和乳腺炎等多種疾病。美國(guó)在1961年首次從患乳腺炎的牛乳中分離到該病原。國(guó)內(nèi)是在2008年首次從患肺炎的犢牛肺臟中分離到Mb，此后在國(guó)內(nèi)開始蔓延。目前該病原在國(guó)內(nèi)外傳播廣泛，造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。在綜合前期分析研究的基礎(chǔ)上，本文系統(tǒng)開展了抗體消長(zhǎng)規(guī)律、T細(xì)胞亞群、T淋巴細(xì)胞免疫特性以及細(xì)胞因子等基礎(chǔ)性研究分析，旨在豐富牛支原體免疫原性研究?jī)?nèi)容，

2、為進(jìn)一步篩選優(yōu)勢(shì)菌株提供理論參考，也為后續(xù)Mb免疫機(jī)制和致病機(jī)理的探討、診斷試劑盒研發(fā)、疫苗研制等進(jìn)一步研究奠定理論基礎(chǔ)。
　　 1、牛支原體菌株復(fù)蘇、增殖培養(yǎng)、PCR鑒定以及濃度測(cè)定
　　 本試驗(yàn)采用自主改良的支原體培養(yǎng)基對(duì)前期篩選的3株Mb菌株進(jìn)行復(fù)蘇、增殖培養(yǎng)，通過基于M.b保守oppD/F基因設(shè)計(jì)的特異性引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增鑒定，并采用液體培養(yǎng)顏色變化單位(CCU)法對(duì)菌液進(jìn)行濃度測(cè)定。研究發(fā)現(xiàn)M.b在自主改良的E

3、ton，s液體培養(yǎng)基上生長(zhǎng)良好，培養(yǎng)時(shí)間有效得到縮減，培養(yǎng)24h后培養(yǎng)基開始變色，而48h后菌落即可達(dá)到對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期;3株菌株菌液濃度均達(dá)109CCU/mL以上;建立的Mb PCR鑒定方法特異性好、靈敏度高、操作簡(jiǎn)單。
　　 2、牛支原體接種小鼠后機(jī)體抗體消長(zhǎng)規(guī)律的研究
　　 為了確定3株牛支原體菌株在小鼠體內(nèi)抗體動(dòng)態(tài)變化水平，選擇優(yōu)勢(shì)菌株，本試驗(yàn)采用ELISA方法，測(cè)定了接種小鼠后不同時(shí)間段小鼠機(jī)體抗體，并分析其消長(zhǎng)規(guī)律

4、。結(jié)果顯示，三株牛支原體菌株接種后均能引起小鼠機(jī)體抗體水平的增長(zhǎng)，并呈現(xiàn)規(guī)律性下降，其中在攻毒后第一周，W70組抗體水平顯著高于1738組和Q3組(P＜0.01);攻毒后的第二周，W70組抗體水平＞Q3組抗體水平＞1738組抗體水平，三組彼此之間的抗體水平差異均極顯著(P＜0.01);攻毒三周后各組抗體水平開始下降，差異顯著。雖然三株菌株在接種后第一周均產(chǎn)生抗體，但1738株菌株相對(duì)W70，Q3兩株菌株在后期的抗體水平增加速度緩慢，抗體

5、峰值水平也相對(duì)不明顯。而W70，Q3兩株菌株均在接種后第二周抗體水平達(dá)到峰值，隨后抗體水平逐漸下降，最后趨于恒定變化。其中W70株產(chǎn)生抗體較為明顯，不僅產(chǎn)生速度較快而且產(chǎn)生的抗體滴度較高，可作為后備疫苗制作參考菌株。
　　 3、牛支原體接種小鼠后機(jī)體T細(xì)胞亞群的研究
　　 通過觀察感染牛支原體小鼠CD4+/CD8+值的變化，為進(jìn)一步探討其免疫機(jī)制提供依據(jù)。本試驗(yàn)將120只Balb/C小鼠隨機(jī)分為四組，分別接種不同菌株(W

6、70菌株、Q3菌株、1738菌株、對(duì)照組)并在0d，7d，14d，21d，28d，35d采集外周全血，流式細(xì)胞檢測(cè)儀檢測(cè)T細(xì)胞亞群，計(jì)算CD4+/CD8+值。結(jié)果顯示小鼠接種牛支原體后CD4+細(xì)胞數(shù)量均上升，CD8+細(xì)胞含量下降，CD4+/CD8+比值分別在第一、二周達(dá)到最大值后開始下降，其中，W70菌株在攻毒后第二周達(dá)到最大值，與其他三組差異極顯著，其他兩組之間差異不顯著。其CD4+/CD8+比值升高明顯說明在接種牛支原體菌株后，W7

7、0菌株較其他兩株菌株能更能促進(jìn)機(jī)體外周血淋巴細(xì)胞增殖活化，增強(qiáng)機(jī)體的細(xì)胞免疫功能，發(fā)揮免疫作用。同時(shí)也為我們了解牛支原體在動(dòng)物機(jī)體內(nèi)其CD4+、CD8+淋巴細(xì)胞在識(shí)別抗原和細(xì)胞免疫中的機(jī)理和作用提供理論參考。
　　 4、支原體接種小鼠后機(jī)體T淋巴細(xì)胞免疫特性的研究
　　 采用E-玫瑰花環(huán)試驗(yàn)檢測(cè)Balb/C小鼠的細(xì)胞免疫狀況。試驗(yàn)結(jié)果顯示，各組在接種后均能提高花環(huán)形成率，其中在接種后14天，W70菌株組的玫瑰花環(huán)形成率最

8、高為22％，最低也是在35d后，其花環(huán)形成率為13％，說明三株M.b菌株中W70菌株更能刺激機(jī)體免疫應(yīng)答，增強(qiáng)機(jī)體細(xì)胞免疫功能，促進(jìn)淋巴細(xì)胞的增殖和分化。
　　 5、牛支原體接種小鼠后機(jī)體細(xì)胞因子變化的研究
　　 為了探討白細(xì)胞介素-1(IL-1)、白細(xì)胞介素-6(IL-6)、腫瘤壞因子-a(TNF-a)在Balb/C小鼠體內(nèi)的表達(dá)及其與病情嚴(yán)重程度的關(guān)系，本試驗(yàn)選擇三株牛支原體菌株接種Balb/C小鼠，分別在不同時(shí)間段

9、采集凝血分離血清，采用ELISA法檢測(cè)3組IL-1、IL-6、TNF-a細(xì)胞因子含量和探討在機(jī)體內(nèi)表達(dá)情況。結(jié)果顯示，牛支原體感染小鼠后血清中IL-1、IL-6及TNF-a水平明顯升高，與對(duì)照組差異顯著;血清中IL-1、IL-6及TNF-a水平增高，表明細(xì)胞因子IL-1、IL-6及TNF-a參與了牛支原體肺炎的發(fā)生、發(fā)展，且與疾病的感染程度緊密相關(guān)。其中W70組IL-6、TNF-a水平顯著高于Q3組合1738組，說明w70菌株更能刺激機(jī)

10、體產(chǎn)生炎癥反應(yīng)，促進(jìn)T、B淋巴細(xì)胞增殖活化分泌相關(guān)炎性細(xì)胞因子。
　　 6、牛支原體接種小鼠后臟器指數(shù)變化的研究
　　 通過研究牛支原體對(duì)小鼠臟器指數(shù)（肺臟指數(shù)，脾臟指數(shù)和胸腺指數(shù)）的變化，探討牛支原體對(duì)機(jī)體感染部位以及免疫器官的影響。結(jié)果表明，在Mb感染Balb/C小鼠實(shí)驗(yàn)中，與對(duì)照組相比各試驗(yàn)組小鼠脾指數(shù)和胸腺指數(shù)變化與對(duì)照組差異極顯著(P＜0.01)。但是試驗(yàn)組之間差異不顯著，因此我們不難得出，不同Mb菌株感染小鼠