胸膜肺炎放線桿菌ApxI毒素基因突變致弱株的構(gòu)建及免疫原性分析.pdf

1、胸膜肺炎放線桿菌(APP)是豬傳染性胸膜肺炎的致病病原。本文利用基因工程技術(shù)成功構(gòu)建了胸膜肺炎放線桿菌apxⅠC基因插入失活突變菌株和apxⅠA基因部分缺失突變菌株，并分析了突變菌株的免疫原性，為研制對不同血清型具有交叉保護(hù)活性的豬傳染性胸膜肺炎減毒活疫苗奠定了基礎(chǔ)。 利用PCR技術(shù)擴(kuò)增出APP血清10型apxⅠC基因及其上下游約2.8kb的基因片段，經(jīng)克隆測序后在apxⅠC基因下游XhoⅠ位點(diǎn)插入大小為0.9kb的氯霉素抗性基

2、因片段，構(gòu)建出轉(zhuǎn)移載體pUIC-Chlr。經(jīng)電轉(zhuǎn)化將轉(zhuǎn)移載體導(dǎo)入APP血清10型野生菌株(D13039)，通過同源重組獲得突變菌株D13039C-Chlr，對突變菌株進(jìn)行了鑒定和生物學(xué)特性分析。結(jié)果表明，突變菌株的增殖能力不受影響，能正常分泌ApxⅠ毒素蛋白，溶血活性和對小鼠的毒力大大降低，且可穩(wěn)定傳代；免疫仔豬后對同種血清型和不同血清型菌株的攻毒可提供部分交叉保護(hù)活性。 為分析ApxⅠ毒素蛋白不同功能區(qū)的免疫原性，利用PCR技

3、術(shù)擴(kuò)增出APP血清10型大小約3.2kb的apxⅠA基因及其N端(1.4kb)和C端(1.8kb)基因片段，經(jīng)克隆測序后分別插入原核表達(dá)載體pET-32a中進(jìn)行原核表達(dá)，進(jìn)而分析了表達(dá)蛋白的免疫原性。結(jié)果表明，表達(dá)的融合蛋白大小分別約為125kDa、65kDa和80kDa；表達(dá)的ApxⅠA蛋白免疫小鼠，可誘導(dǎo)對APP血清10型攻毒的100％的保護(hù)，但對APP血清1型的攻毒保護(hù)率僅為40％，與天然ApxⅠ毒素蛋白免疫活性無顯著差異；Apx

4、ⅠA-N端表達(dá)蛋白免疫活性顯著高于ApxⅠA-C端表達(dá)蛋白，提示ApxⅠA毒素蛋白N端含有更多的免疫活性位點(diǎn)，在ApxⅠ毒素蛋白的免疫活性中發(fā)揮更重要作用。 利用PCR技術(shù)從APP血清10型基因組中擴(kuò)增出apxⅠA基因C端的上游約1.8kb及下游約1.7kb的基因片段，從質(zhì)粒pACYC184中擴(kuò)增出約1.1kb的氯霉素抗性基因片段，經(jīng)克隆測序后將上述基因片段串聯(lián)并插入pUC19的相應(yīng)位點(diǎn)，構(gòu)建出轉(zhuǎn)移載體pUIA-Chlr，經(jīng)電轉(zhuǎn)

5、化將轉(zhuǎn)移載體導(dǎo)入APP血清10型野生菌株(D13039)，經(jīng)同源重組獲得缺失ApxⅠA毒素蛋白C端功能區(qū)而保留毒素免疫原性且毒素失活的突變菌株D13039A-Chlr，對突變菌株進(jìn)行了鑒定和生物學(xué)特性分析。結(jié)果表明，突變菌株可正常增殖，無溶血性，僅能表達(dá)ApxⅠA毒素N端約48kDa的蛋白，對小鼠的毒力降低100倍以上，且可穩(wěn)定傳代；免疫仔豬后對同種血清型和不同血清型菌株的攻毒均可降低死亡率和肺損傷程度，提示該突變菌株具有較好的交叉保護(hù)