屎腸球菌Dnak缺失株的構(gòu)建及其耐熱特性的研究.pdf

1、益生菌因?yàn)槠湟嫔匦杂泻艽蟮纳虡I(yè)價(jià)值，在國(guó)外益生菌已經(jīng)得到了廣泛的應(yīng)用。當(dāng)足夠的活菌數(shù)被宿主攝入以后將有利于動(dòng)物機(jī)體的健康，如防氧化、助免疫、防感染等。然而在產(chǎn)品的加工、貯藏和使用過程中受環(huán)境條件如熱、酸、氧等因素影響，導(dǎo)致益生菌活菌數(shù)下降而成為限制其應(yīng)用的一個(gè)瓶頸，尤其乳酸菌耐熱性能差而限制了其應(yīng)用前景。本實(shí)驗(yàn)室在大量分離乳酸菌樣本研究中，自主分離了一株豬源耐熱益生乳酸菌—屎腸球菌，為了研究其耐熱機(jī)制，本研究首次構(gòu)建了該菌的分子缺失平

2、臺(tái)，并通過同源重組的方法敲除熱休克蛋白Dank基因以探索熱休克蛋白Dnak對(duì)其耐熱的影響。本實(shí)驗(yàn)取得的結(jié)果如下:
　　 1.革蘭氏陽(yáng)性菌缺失株的構(gòu)建:屎腸球菌HDRsEf1對(duì)氨芐青霉素表現(xiàn)敏感，利用定向克隆技術(shù)，將β-內(nèi)酰胺酶編碼序列（CDS序列）置換pSET4S載體中壯觀霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶編碼序列（CDS序列），首次成功構(gòu)建含有β-內(nèi)酰胺酶的溫敏自殺性載體，命名為pSET7S。擴(kuò)增熱休克蛋白Dnak基因，連接pMD18-T載體，測(cè)

3、序、BLAST比對(duì)分析找出其同源臂序列，重疊PCR擴(kuò)增左右同源臂連接屎腸球菌自殺性質(zhì)粒pSET7S，重組質(zhì)粒命名為pSET7S-LR。通過菌液PCR、基因測(cè)序和Southern Blot驗(yàn)證，成功獲得缺失Dnak基因的屎腸球菌;
　　 2.豬源屎腸球菌耐熱性質(zhì)的研究:(1)生長(zhǎng)曲線的測(cè)定結(jié)果表明，屎腸球菌Dnak缺失株的生長(zhǎng)特性與野生株相似;(2)屎腸球菌缺失株和野生株分別在40℃、45℃、50℃、55℃、60℃、65℃、70℃

4、培養(yǎng)15分鐘，細(xì)菌計(jì)數(shù)結(jié)果表明:40℃、45℃無顯著性差異，50℃、55℃、65℃缺失株活菌數(shù)少于野生株，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，p小于0.05，60℃、70℃缺失株活菌數(shù)少于野生株，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，p小于0.0.1;(3)屎腸球菌野生株和缺失株分別在40℃、60℃、70℃熱應(yīng)激1小時(shí)，每隔10分鐘取樣進(jìn)行細(xì)菌計(jì)數(shù)，結(jié)果表明:60℃20min、30min、40min缺失株活菌數(shù)少于野生株，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，p小于0.01，70℃10min、

5、20min缺失株和野生株差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，p小于0.01;(4)屎腸球菌野生株和缺失株分別接種于含0％、0.15％、0.3％、0.5％膽鹽MRS培養(yǎng)基中37℃培養(yǎng)12小時(shí)后，MRS平板計(jì)數(shù)結(jié)果表明:膽鹽濃度0.15％、0.3％、0.5％缺失株活菌數(shù)少于野生株，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，p小于0.01;(5)屎腸球菌野生株和缺失株分別接種子pH2.0的鹽酸溶液中，37℃培養(yǎng)0h，0.5h，1h，1.5h，2h后取培養(yǎng)液稀釋至合適倍數(shù)，MRS平板計(jì)