豬鏈球菌2型cps2E基因缺失株構建及生物學特性研究.pdf

1、豬鏈球菌病是由豬鏈球菌(Streptococcus suis,S.suis)感染引起的人畜共患疾病，不僅對全球養(yǎng)豬業(yè)造成巨大沖擊，而且嚴重威脅人類的公共健康。在中國，1998年和2005年先后暴發(fā)兩次人感染豬鏈球菌的疫情，這引起了國內(nèi)外學者對該病的廣泛關注。已知豬鏈球菌通過破壞宿主的上皮屏障進入血液，進而侵襲不同的器官使宿主患病。該菌主要引起豬的急性敗血癥、腦膜炎、關節(jié)炎、急性死亡等，在人體中則會導致細菌性腦膜炎和鏈球菌中毒性休克綜合征

2、等疾病。豬鏈球菌血清型眾多，其中豬鏈球菌2型(Streptococcus suis serotype 2，S.suis2)是主要的病原菌，具有毒力強、流行廣、臨床分離率高的特點。
　　近年來，對S.suis2致病機理及毒力因子的研究表明，莢膜多糖(Capsular Polysaccharide，CPS)是該病原菌公認的毒力因子之一。Smith等已經(jīng)獲得了合成豬鏈球菌2型CPS的基因簇，Van Calsteren也初步預測了該基因簇

3、編碼的蛋白在CPS重復單元合成中的酶促功能。盡管如此，尚缺少實驗進一步證實這些基因的具體功能。因此，為了加深對豬鏈球菌2型CPS在其致病過程中所發(fā)揮的作用以及多樣性和進化的了解，進一步研究豬鏈球菌2型CPS生物合成的相關基因是必需的。
　　Yother預測肺炎鏈球菌2型的Cps2E蛋白在其Wzx/Wzy依賴的CPS生物合成途徑中發(fā)揮著起始糖基轉移酶的作用。此外，Smith等經(jīng)試驗發(fā)現(xiàn)S.suis2的cps2E基因具有較高的2型特異

4、性。因此本研究選取S.suis2的CPS生物合成相關基因cps2E，主要研究該基因在CPS生物合成中的功能，并為其他CPS合成相關基因的功能研究奠定基礎。本文主要研究內(nèi)容如下:
　　1.豬鏈球菌2型cps2E基因生物信息學分析:
　　將S.suis的3株代表性菌株SC84、05ZYH33及P1/7的CpsE蛋白序列與不同種屬細菌來源的相應蛋白進行同源比對及親緣關系分析。結果表明:S.suis的SC84菌株CpsE蛋白質(zhì)序列與

5、05ZYH33、P1/7菌株的一致性分別高達98％和100％，具有同源性;同時，S.suis的CpsE蛋白與肺炎鏈球菌、無乳鏈球菌之間的親緣關系相近。
　　2.cps2E基因缺失突變株Δcps2E的構建:
　　根據(jù)S.suis2菌株05ZYH33全基因組序列(Accesion No.:NC_009442)設計引物，其中cps2E的基因位點為SSU05_0568。以S.suis2四川分離菌株SC19的基因組為模板進行重疊延伸P

6、CR擴增，獲得cps2E基因上下游同源臂的連接產(chǎn)物。將擴增產(chǎn)物與pSET4s穿梭質(zhì)粒載體分別雙酶切處理后進行連接，最終獲得重組質(zhì)粒pSET4s-Δcps2E，經(jīng)PCR擴增及雙酶切鑒定成功。
　　將獲取的重組質(zhì)粒pSET4s-Δcps2E電轉化到野生菌株SC19的感受態(tài)細胞中。進而利用pSET4s質(zhì)粒的溫敏性、壯觀霉素抗性及同源重組原理篩選獲得cps2E基因缺失突變株。菌株經(jīng)PCR擴增及測序證實S.suis2的cps2E基因缺失突變

7、株Δcps2E構建成功。
　　3.突變株Δcps2E生物學性狀分析:
　　將獲得的cps2E基因缺失突變株Δcps2E與野生菌株SC19于37℃進行生長特性分析。繼而分別將突變株Δcps2E與野生菌株SC19腹腔接種4周齡BALB/c雌性小鼠后，再經(jīng)2次腹腔液轉種，分離純化血中的細菌。然后對分離后的兩種菌株進行革蘭氏染色，透射電鏡觀察以及莢膜粗多糖的提取。研究結果表明:Δcps2E對數(shù)期的生長速率明顯加快，穩(wěn)定期的菌量也明顯

8、增大;Δcps2E的形態(tài)多呈單個或兩兩排列，不同于野生菌株的鏈狀排列，并且Δcps2E的莢膜同野生菌株存在顯著差異;Δcps2E莢膜粗多糖的提取率僅為野生菌株的34.52％。
　　4.突變株Δcps2E生物學功能分析:
　　將突變株Δcps2E與野生菌株SC19于37℃，5％CO2條件下進行細胞粘附侵入及吞噬試驗。一方面，對人子宮頸癌細胞(Hela)的粘附侵入試驗結果表明:Δcps2E的粘附能力差異不明顯，而侵入能力顯著增強

9、，是野生菌株的1.65倍;另一方面，小鼠肺泡巨噬細胞（RAW264.7）的吞噬試驗結果表明:在4個互作時間段內(nèi)，RAW264.7對Δcps2E的吞噬率均極顯著高于野生菌株，故突變株Δcps2E的抗吞噬能力極顯著降低，更易被機體清除。
　　突變株Δcps2E與野生菌株SC19分別腹腔接種4周齡BALB/c小鼠，LD50的測定結果顯示突變株Δcps2E毒力下降4.47倍，cps2E基因對細菌的致病性存在影響。小鼠存活率試驗中，突變株Δ