屎腸球菌HDRsEf1及其胞外多糖“跨層”誘導(dǎo)CD4+T細(xì)胞定向分化的研究.pdf

1、屎腸球菌HDRsEf1菌株是從我國(guó)地方優(yōu)良品種“通城豬”直腸內(nèi)容物中獲得的優(yōu)良益生菌株，具有降低仔豬腹瀉率、提高仔豬生長(zhǎng)性能和增強(qiáng)腸道屏障等優(yōu)點(diǎn)。已有研究發(fā)現(xiàn)HDRsEf1能保護(hù)IPEC-J2細(xì)胞的完整性，降低IPEC-J2細(xì)胞IL-8的分泌，其抑炎效應(yīng)與其胞外多糖EPS有關(guān)，這為HDRsEf1抑制炎癥效應(yīng)、維持機(jī)體腸道穩(wěn)態(tài)機(jī)制研究提供了必要依據(jù)。已有HDRsEf1體外抑炎效應(yīng)的研究結(jié)果來(lái)自豬腸上皮細(xì)胞系，而單一的腸上皮細(xì)胞系只能在一定

2、程度上模擬動(dòng)物腸道，因此，本研究選取腸道中的腸上皮細(xì)胞及下層處于免疫核心地位的DC、CD4+T細(xì)胞，構(gòu)建3種細(xì)胞共培養(yǎng)模型來(lái)模擬腸道細(xì)胞互作，從HDRsEf1直接或間接刺激的DC對(duì)CD4+T細(xì)胞定向分化影響的角度，來(lái)闡明屎腸球菌HDRsEf1及其胞外多糖的抑制炎癥效應(yīng)機(jī)制。為了使腸上皮細(xì)胞可能具有的作用、腸上皮細(xì)胞與DC的互作效應(yīng)得到顯現(xiàn)，細(xì)胞共培養(yǎng)模中DC接受益生菌刺激的形式進(jìn)行了三種設(shè)計(jì)，分別稱(chēng)為直接組(HDRsEf1或EPS直接刺

3、激BMDC)、間接組(HDRsEf1或EPS刺激MODE-K上清處理BMDC)、Transwell組(MODE-K和BMDC分處上下室，HDRsEf1或EPS刺激上室中MODE-K)。主要研究?jī)?nèi)容及結(jié)果如下:
　　(1)通過(guò)HDRsEf1及EPS對(duì)MODE-K跨膜電阻(TEER)的影響和細(xì)胞毒性試驗(yàn)，分別確定HDRsEf1刺激DC的劑量為1×107CFU、APS和NPS的使用劑量分別是25μg/mL、25μg/mL和50μg/mL

4、;從小鼠骨髓中誘導(dǎo)培養(yǎng)小鼠BMDC，將第5d未成熟BMDC用于后續(xù)試驗(yàn);從小鼠脾臟經(jīng)免疫磁珠分選出初始CD4+T細(xì)胞，流式鑒定純度高達(dá)99％，為共培養(yǎng)細(xì)胞模型奠定基礎(chǔ)。
　　(2)HDRsEf1對(duì)BMDC成熟和其細(xì)胞因子的影響。在直接組，HDRsEf1能促進(jìn)BMDC成熟，而間接組和Transwell組，HDRsEf1能抑制BMDC的成熟。在直接組HDRsEf1能顯著上調(diào)其促炎因子IL-1β和TNF-α的分泌，在間接組和Transw

5、ell組，HDRsEf1能抑制促炎因子IL-1β分泌、上調(diào)IL-10和TGF-β的分泌。提示HDRsEf1在機(jī)體腸道中可通過(guò)DC直接發(fā)揮抑炎效應(yīng)。
　　(3)HDRsEf1刺激的BMDC對(duì)CD4+T細(xì)胞定向分化的影響。在直接組，HDRsEf1促進(jìn)CD4+T細(xì)胞向Th1和Th2型的分化，且Th1型占主導(dǎo)地位，達(dá)到30.4％;在間接組，HDRsEf1并不促進(jìn)CD4+T細(xì)胞向Th1、Th2和Th17型的分化;在Transwell組，HD

6、RsEf1顯著抑制CD4+T細(xì)胞向Th1亞型和Th17亞型分化、促進(jìn)CD4+T細(xì)胞向Th2型分化，Th2的比例達(dá)16.6％。提示HDRsEf1在機(jī)體腸道中可通過(guò)DC誘導(dǎo)CD4+T細(xì)胞的定向分化，間接發(fā)揮抑炎效應(yīng)。
　　(4)HDRsEf1的EPS對(duì)BMDC成熟和其細(xì)胞因子的影響。在直接組25μg/mL APS和50μg/mL NPS促進(jìn)BMDC成熟，上調(diào)其IFN-γ，IL-12和TGF-βmRNA的表達(dá)，上調(diào)IL-1β，IL-6，

7、TNF-α等促炎因子的分泌。間接組25μg/mL APS和50μg/mL NPS均能抑制BMDC成熟，抑制IL-12，IFN-γmRNA表達(dá)，抑制IL-1β和MCP-1的分泌。在直接組25μg/mL APS和NPS均能顯著促進(jìn)BMDC成熟，上調(diào)促炎因子IL-lβ、IL-6和TNF-α的分泌;在間接組和Transwel1組兩者均能抑制BMDC表面分子的表達(dá)、顯著抑制促炎因子分泌。提示HDRsEf1的EPS在機(jī)體腸道中可抑制DC的成熟，并通