虎紋蛙病毒TK基因鑒定、缺失株的構(gòu)建及其轉(zhuǎn)染斑馬魚特性研究.pdf

1、虎紋蛙病毒(TFV)是致使養(yǎng)殖虎紋蛙(Rana tigrina rugulosa)和中華鱉(Pelodiscus sinensis)發(fā)病致死的主要病原之一，屬于虹彩病毒科(Iridoviridae)蛙病毒屬(Ranavirus)。TFV最早從廣東省南海市某虎紋蛙養(yǎng)殖場(chǎng)患病的虎紋蛙蝌蚪上分離、鑒定，其全基因序列已在2002年完成測(cè)定，但至今其侵染宿主的機(jī)制不清楚，用于防治的疫苗也仍沒有開發(fā)出來，因此本文研究的目的是以TFV的TK基因?yàn)檠芯?/p>

2、對(duì)象，從分子水平上為探討病毒的感染機(jī)制和研制有效的基因工程疫苗奠定基礎(chǔ)。
　　 本研究以在我國(guó)分離的TFV為親本病毒，通過生物信息學(xué)的技術(shù)鑒定了TFV的ORF91R為胸苷激酶(thymidine kinase，TK)基因，其結(jié)構(gòu)域中有ATP酶的結(jié)合位點(diǎn)，在進(jìn)化上與細(xì)胞中TK2型和線粒體TK靠近，與其他的蛙虹彩病毒比較，核苷酸和氨基酸的同源性均較高，最高可達(dá)99％，然后對(duì)其進(jìn)行了基因克隆，分別在大腸桿菌中進(jìn)行了原核表達(dá)和在腺病毒中

3、進(jìn)行了真核表達(dá)，制備了鼠抗TK的多克隆抗體。轉(zhuǎn)錄時(shí)相分析其屬于早期基因，通過激光共聚焦顯示其亞細(xì)胞定位于細(xì)胞質(zhì)中。
　　 借鑒痘病毒和皰疹病毒的TK基因是病毒的毒力基因，又是病毒復(fù)制的非必需基因，我們構(gòu)建了TK基因缺失的TFV毒株。試驗(yàn)中首先克隆了TK基因兩側(cè)約1Kb左右的核苷酸序列作為轉(zhuǎn)移載體的左右同源臂，再將由CMV啟動(dòng)子控制的綠色熒光蛋白基因(EGFP)表達(dá)盒定向插入到轉(zhuǎn)移載體PB91TK的左右同源臂中間，構(gòu)建了含有報(bào)告基

4、因EGFP的轉(zhuǎn)移載體PBTK-EGFP。然后通過脂質(zhì)體法將轉(zhuǎn)移載體PBTK-EGFP轉(zhuǎn)染已經(jīng)感染TFV病毒的BHK細(xì)胞中，在細(xì)胞培養(yǎng)液中有5-溴脫氧尿嘧啶(BrdU)存在的條件下，利用143TK-細(xì)胞經(jīng)過3輪的熒光蝕斑篩選，純化以及PCR鑒定，獲得了一株表達(dá)EGFP基因的重組病毒rTFVTK-。將重組病毒rTFVTK-在BHK和FHM細(xì)胞上連續(xù)傳20代，并進(jìn)行PCR檢測(cè)，在電鏡下觀察其形態(tài)結(jié)構(gòu)，病毒滴度和遺傳穩(wěn)定性測(cè)定。結(jié)果顯示，重組病

5、毒TFV-GFP與親本TFV病毒在形態(tài)上無多大的差別，EGFP基因穩(wěn)定表達(dá)，病毒滴度與親本毒株相似，表明該重組病毒性狀穩(wěn)定，TK基因缺失對(duì)病毒增殖影響不大。將重組病毒rTFVTK-免疫Balb/C鼠，測(cè)定了其中和抗體和EGFP抗體消長(zhǎng)規(guī)律，結(jié)果表明重組病毒與親本病毒誘導(dǎo)的中和抗體水平無明顯差異，從接種后14d即可檢測(cè)到低水平的中和抗體，21d抗體水平有所增加，而重組病毒免疫組Balb/C鼠在接種14d即可檢測(cè)到明顯的EGFP抗體，21d

6、抗體水平有所提高。
　　 為了借助模式生物斑馬魚來研究外源基因功能，我們使用了PEI作為基因載體介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)染了斑馬魚細(xì)胞和在斑馬魚中表達(dá)。試驗(yàn)中我首先構(gòu)建了含TK基因帶GFP報(bào)告基因的真核表達(dá)質(zhì)粒(pCXGFP-TK)，然后以脂質(zhì)體作為對(duì)照，PEI以不同的N/P比與DNA復(fù)合，測(cè)定了PEI-DNA復(fù)合物的粒徑和電位，電鏡下觀察了復(fù)合物的形態(tài)，凝膠電泳阻滯實(shí)驗(yàn)比較，對(duì)斑馬魚細(xì)胞的毒性，以及在斑馬魚細(xì)胞中表達(dá)，結(jié)果顯示PEI能有效地