禽白血病病毒和柔嫩艾美耳球蟲共感染致病機(jī)制研究.pdf

1、禽白血?。ˋvian Leukosis，AL）是指由反轉(zhuǎn)錄病毒科禽反轉(zhuǎn)錄病毒屬的禽白血病病毒（ALV）引起的雞的各種可傳播的良性和惡性腫瘤。ALV主要侵害宿主的免疫細(xì)胞，造成雞體免疫抑制，造成其他病原繼發(fā)感染。J亞群是90年代初從肉雞中分離到的ALV，現(xiàn)在已經(jīng)迅速蔓延到很多國家，我國關(guān)于ALV感染的報道也很多，給我國養(yǎng)雞業(yè)造成了巨大經(jīng)濟(jì)損失。近年來，被命名為K亞群的ALV陸續(xù)從中國的不同地方品系雞群中分離出，但這些中國分離株的致病性仍有

2、待進(jìn)一步研究。雞球蟲病是一類由專性細(xì)胞內(nèi)寄生的艾美耳屬原蟲引起的雞腸道原蟲疾病。艾美耳屬入侵宿主腸上皮細(xì)胞，損害腸道的完整性和腸粘膜免疫，所以感染雞經(jīng)常存在與腸道內(nèi)的其他寄生蟲、細(xì)菌以及各種病毒的共感染現(xiàn)象。E. tenella是其中致病性最強(qiáng)的蟲種之一，主要寄生在盲腸上皮細(xì)胞內(nèi)。球蟲在環(huán)境中無處不在，高達(dá)90％的雞群中有球蟲的存在，并且有大量雞感染球蟲。如果該病原的感染未能有效控制，往往造成高死亡率。雞群中不同病原（細(xì)菌、病毒、或是寄

3、生蟲）共感染的現(xiàn)象十分普遍，尤其是在發(fā)病雞群中病原共感染的比例很高，這往往導(dǎo)致它們對雞體的致病性增強(qiáng)。病原共感染的現(xiàn)象對于疾病的診斷和防控是個極大的挑戰(zhàn)。鑒于ALV和球蟲都是雞群中常見的病原，對感染雞都造成免疫損傷，同時都存在與其他病原共感染的現(xiàn)象，關(guān)于這兩種病原共感染的現(xiàn)象未見報道，本課題開展對ALV和雞球蟲的共感染研究，分析它們共感染的現(xiàn)狀和致病性，并試圖通過高通量技術(shù)闡明不同病原共感染致病調(diào)節(jié)的分子機(jī)制。
　　腸道微生物區(qū)系

4、十分復(fù)雜，含有豐富多樣的菌群，腸道微生物基因組被譽(yù)為宿主的“第二基因組”。腸道菌群不僅在機(jī)體的消化、吸收和營養(yǎng)方面發(fā)揮重要作用，還能夠刺激腸道上皮細(xì)胞發(fā)育，幫助塑造腸道免疫功能，各種生理和心理健康問題也與腸道菌群的紊亂有關(guān)，所以近年來腸道菌群的功能越來越受到科研工作者的重視。雞盲腸是雞體內(nèi)微生物區(qū)系最復(fù)雜的器官，1克（g）盲腸內(nèi)容物（濕重）大約含有1011的細(xì)菌，其中包括很多條件致病菌，當(dāng)雞體免疫功能改變后，這些條件致病菌為繼發(fā)感染提供

5、了大量的資源。通過宏基因組學(xué)直接抽提樣本中的宏基因組進(jìn)行高通量測序和生物信息學(xué)分析，相比傳統(tǒng)的依賴于培養(yǎng)的方法能夠同時檢測腸道內(nèi)整體的菌群分布。通過高通量技術(shù)解析病原感染后腸道菌群的變化可能有助于我們闡明病原的致病機(jī)制。
　　后基因組時代，蛋白質(zhì)作為生物功能的執(zhí)行者已經(jīng)成為生命科學(xué)領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。蛋白質(zhì)組學(xué)是對機(jī)體器官、組織或細(xì)胞的全部蛋白質(zhì)的表達(dá)水平、蛋白修飾、蛋白之間的相互作用與功能等進(jìn)行高通量篩選和分析，比傳統(tǒng)的單個蛋白的研

6、究更能準(zhǔn)確反映機(jī)體的整體狀態(tài)。因此作為一種全新的系統(tǒng)生物學(xué)研究方法，蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)為篩選病原感染中可能發(fā)揮關(guān)鍵作用的差異蛋白，并進(jìn)一步揭示致病機(jī)理提供了強(qiáng)有力的幫助。
　　1.雞群中ALV和球蟲共感染現(xiàn)狀的流行病學(xué)調(diào)查
　　本研究通過病原學(xué)檢測結(jié)合分子生物學(xué)技術(shù)進(jìn)行雞群中ALV和球蟲共感染現(xiàn)狀的流行病學(xué)調(diào)查，結(jié)果顯示，在我們調(diào)查的范圍內(nèi)（山東濟(jì)寧、泰安肥城和新泰），所有地區(qū)的大部分雞場樣品都檢出球蟲，個別雞場的樣品球蟲檢出率

7、高達(dá)90%，而只有來源于泰安肥城不同雞場的樣品檢出ALV，陽性率高達(dá)33.3%，擴(kuò)增gp85序列測序發(fā)現(xiàn)均為ALV-J感染。經(jīng)統(tǒng)計發(fā)現(xiàn)泰安市肥城地區(qū)ALV和雞球蟲共感染的比例達(dá)13.33%。本研究首次證實(shí)雞群中確實(shí)存在ALV和球蟲共感染的現(xiàn)象。
　　2. ALV分離株JS11C1的全基因組測序、傳染性克隆構(gòu)建及其生物學(xué)活性分析
　　將中國地方品種雞ALV分離株JS11C1的全基因組測序，構(gòu)建其傳染性克隆，并將它的全基因組序列

8、和部分作用元件與GenBank中已經(jīng)發(fā)表的其它的ALV進(jìn)行比較。結(jié)果顯示JS11C1基因組全長7707 bp，基因組結(jié)構(gòu)屬于典型的復(fù)制完整型的C型反轉(zhuǎn)錄病毒，不含有腫瘤基因。傳染性克隆拯救出的病毒復(fù)制能力和生物學(xué)活性與母本病毒一致?；谡麄€基因組的序列比較結(jié)果進(jìn)一步確定JS11C1及其它幾個ALV毒株與其它已知的亞群同源性比較低，可以分類為一個新的亞群K。本研究基于JS11C1整個基因組序列與已知ALV六個亞群的同源性比較，為K亞群的建

9、立提供了分子依據(jù)，并從基因組水平進(jìn)一步確立了它的分類地位；首次構(gòu)建了該類ALVs的傳染性克隆，為進(jìn)一步進(jìn)行這類病毒的體外生物學(xué)活性研究、基因組結(jié)構(gòu)和功能以及致病的分子機(jī)制提供平臺。
　　3.不同亞群ALV與E. tenella共感染對不同品種雞的致病性分析
　　本研究進(jìn)行不同亞群ALV（J：rNX0101和K：rJS11C1）與E. tenella共感染對不同品種雞（SPF雞、海蘭褐蛋雞和AA肉雞）的致病性分析。結(jié)果顯示不同

10、亞群ALV分別和E. tenella共感染后不同品種雞死亡率都明顯增加，雞體重減輕。ALV感染加快球蟲疾病病程，E. tenella感染延長ALV感染雞的病毒血癥。與單一病原感染雞和健康雞相比，共感染雞胸腺萎縮、對感染病原和NDV滅活苗的體液免疫水平降低、外周血中淋巴細(xì)胞亞群以及全身和局部細(xì)胞因子轉(zhuǎn)錄水平紊亂。結(jié)果表明不同亞群ALV與E. tenella共感染在對不同品種雞的致病性都具有一定的協(xié)同作用。
　　4. ALV和E. t

11、enella共感染對雞盲腸菌群的影響
　　通過分析ALV和E. tenella感染后雞盲腸菌群的變化揭示不同病原感染及共感染的致病機(jī)制。ALV感染均引起盲腸菌群多樣性增加，共生菌的大量缺失，很多條件致病菌顯著富集，不同亞群ALV感染引起不同條件致病菌的富集。E. tenella感染對雞盲腸菌群最顯著的影響是造成盲腸腸道菌群結(jié)構(gòu)極大程度的改變，多樣性和豐富度急劇降低，與ALV感染類似，大部分常駐菌急劇缺失，同時引起大量條件致病菌的顯

12、著富集。r-NX0101和E. tenella共感染的雞體內(nèi)盲腸菌群呈現(xiàn)多元性變化，感染情況介于球蟲單獨(dú)感染和AJ感染之間，并且造成某些菌在個體中的增殖；而r-JS11C1和E. tenella共感染有明顯的協(xié)同作用，尤其是對一些條件致病菌的進(jìn)一步富集，導(dǎo)致雞體繼發(fā)細(xì)菌感染的幾率增加，這可能與共感染致病性增加有關(guān)。
　　5.不同亞群ALV與E. tenella共感染對雞脾臟蛋白組的影響
　　利用iTRAQ技術(shù)對不同亞群ALV

13、分別和E. tenella共感染雞脾臟以及健康雞脾臟蛋白質(zhì)進(jìn)行了定量蛋白質(zhì)組學(xué)研究，共鑒定蛋白質(zhì)1737個。對鑒定的脾臟蛋白質(zhì)進(jìn)行了功能注釋發(fā)現(xiàn)大部分蛋白參與基本的生物學(xué)代謝過程，并且有很多蛋白參與免疫相關(guān)的生物過程，注釋到不同的病原感染和各種疾病相關(guān)的通路中。其中r-NX0101感染主要影響了宿主的轉(zhuǎn)錄、翻譯以及翻譯后修飾等相關(guān)的功能，以及與腫瘤形成與遷移密切相關(guān)的基質(zhì)粘附蛋白的表達(dá)，這些差異蛋白可能與J亞群ALV的致腫瘤特性密切相關(guān)

14、；r-JS11C1感染主要是富集翻譯后修飾相關(guān)的宿主功能蛋白；E. tenella感染主要是由于其蟲體入侵影響宿主的細(xì)胞組織結(jié)構(gòu)；r-NX0101和E. tenella共感染則對具有細(xì)胞溶解功能蛋白的富集最為顯著，并且還有一些差異蛋白參與到重要的免疫學(xué)相關(guān)的代謝通路；而r-JS11C1和E. tenella共感染則主要影響應(yīng)激和神經(jīng)系統(tǒng)疾病相關(guān)蛋白的表達(dá)。這將為闡明共感染致病機(jī)理提供新思路和理論依據(jù)，增加我們對病原與宿主相互作用的認(rèn)識。