禽白血病病毒FJAU11W1分離株的致病性研究.pdf

1、禽白血病(Avian leukosis, AL)是由禽白血病/肉瘤病毒(Avian Leukosis/Sarcoma virus, ALSV)引起的各種可傳播的良性和惡性腫瘤的總稱。根據(jù)病毒囊膜蛋白抗原特性、宿主范圍和病毒間的干擾作用，可將ALSV分為A～J10個(gè)亞群，ALSV-E系內(nèi)源性病毒，而其余9個(gè)亞群均為外源性ALSV。其中可感染雞的亞群分別是ALSV-A、B、C、D、E和J6個(gè)亞群，而F、G亞群僅僅分離自雉，而H和I亞群也僅分

2、別分離自匈牙利鷓鴣和鵪鶉。根據(jù)轉(zhuǎn)化細(xì)胞和誘導(dǎo)腫瘤產(chǎn)生的速度，可將ALSV分為急性轉(zhuǎn)化型和慢性轉(zhuǎn)化型；根據(jù)基因組缺失與否，又可將ALSV分為完整型和缺陷型 ALSV。本課題對(duì)分離自我國肉種雞群中ALSV病原開展了初步的致病性研究。
　　雞場采集發(fā)病死亡肉種雞實(shí)質(zhì)性腫瘤病料。通過RT-PCR方法檢測(cè)病原：設(shè)計(jì)與腫瘤相關(guān)病毒的基因引物，包括ALV-J、ALV-A,B,C,D,E通用引物1(下稱通用引物1)，REV、MDV。瓊脂糖凝膠電泳

3、顯示，由ALV基因設(shè)計(jì)的通用引物1， RT-PCR后，DL2000Marker指示，顯示出250bp-500bp大小的特異性目的條帶。測(cè)序發(fā)現(xiàn)為312bp目的條帶，為內(nèi)源性ALV。可排除完整ALV-J、REV、MDV所致的腫瘤的病因。
　　病料接種原代 CEF(SPF雞胚制備)，連續(xù)培養(yǎng)四代，4th可見細(xì)胞發(fā)生病變(CPE)，而8th可見典型的“島狀”轉(zhuǎn)化細(xì)胞形態(tài)，而空白對(duì)照組無此細(xì)胞形態(tài)，皆為梭狀形態(tài)，提取8th細(xì)胞毒總DNA，

4、分別使用ALV-A、ALV-B/D、ALV-C、ALV-E、ALV通用引物2、ALV-J、REV、MDV特異性引物進(jìn)行PCR，瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示，只有使用ALV-E、ALV通用引物2為引物時(shí)分別出現(xiàn)相應(yīng)約為1250bp、2400bp的目的片段。
　　將病原傳至7th的CEF毒接種于單層細(xì)胞貼壁量為75%的DF-1細(xì)胞和CEF，分別重新傳代至8th。結(jié)果顯示，CEF出現(xiàn)如上所述的典型轉(zhuǎn)化細(xì)胞形態(tài)，空白組不存在；DF-1接毒組和空

5、白對(duì)照組皆無CPE，而且彼此之間形態(tài)無差別；分別對(duì) CEF接毒組及其空白對(duì)照組；DF-1接毒組及其空白對(duì)照組，提取細(xì)胞總DNA，分別選擇ALV基因組通用引物1，ALV-J、REV、MDV基因組相應(yīng)特異性引物進(jìn)行PCR，擴(kuò)增產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳顯示，只有與CEF接毒組對(duì)應(yīng)的ALV通用引物1獲得250bp-500bp的目的條帶，與上述條帶一致。再將上述樣品DNA，分別選擇ALV-A、ALV-B/D、ALV-C、ALV-E、ALV-J、ALV

6、通用引物2進(jìn)行PCR，擴(kuò)增產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳顯示，同樣只有與CEF接毒組對(duì)應(yīng)的ALV-E、ALV通用引物2分別獲得大小為1000bp、2500bp左右的目的片段。
　　將同時(shí)接種相同的 CEF細(xì)胞毒的 DF-1細(xì)胞和 CEF(接毒后4d)以及空白組CEF進(jìn)行細(xì)胞透射電鏡樣品的制備。透射電鏡觀察結(jié)果顯示：1、只有CEF接毒組存在直徑約為100nm左右的中心黑色，外圍黑灰色并被包裹在“液泡”內(nèi)的病毒粒子，而空白對(duì)照組并沒有任何病毒粒子

7、或形似病毒粒子的存在；2、DF-1接毒組以及空白組不存在任何病毒粒子或形似病毒粒子。
　　將8thCEF細(xì)胞毒接種于6日齡SPF雞胚卵黃囊，并分別設(shè)立125μL/枚(下稱“低劑量組”)、250μL/枚(下稱“中劑量組”)、500μL/枚(下稱“高劑量組”)三個(gè)梯度；以及三個(gè)對(duì)應(yīng)的陰性對(duì)照組，分別接種相應(yīng)劑量的無毒細(xì)胞培養(yǎng)液；另設(shè)一空白對(duì)照組。每組20枚雞胚。結(jié)果顯示：1、高劑量組、中劑量組、低劑量組的未出殼率分別為8/20、5/2

8、0、4/20，對(duì)應(yīng)的陰性對(duì)照組未出殼率分別為1/20、2/20、1/20，空白對(duì)照組為2/20；2、截止試驗(yàn)結(jié)束，包括未出殼的情況，并排除自然死亡情況，高劑量組、中劑量組和低劑量組的死亡率分別為75%、55%、35%，且死亡日齡主要集中在出殼后42日齡內(nèi)。臨床觀察發(fā)現(xiàn)：死亡雞都存在嚴(yán)重貧血現(xiàn)象，雞冠蒼白無色，爪墊出現(xiàn)疑似血管瘤病灶，并出現(xiàn)潰崩。截止試驗(yàn)結(jié)束(出殼后80d)，不同接毒劑量組的肉種雞重量僅為空白對(duì)照組的1/3左右；3、解剖發(fā)

9、病死亡雞發(fā)現(xiàn)，肝、脾、腎較蒼白，存在嚴(yán)重貧血，同時(shí)肝和腎有出血點(diǎn)；4、病理組織切片 HE染色后，鏡檢發(fā)現(xiàn)：肝、腎、腺胃、腸道等血管存在大量粘液樣、均質(zhì)性物質(zhì)，疑似為粘液瘤，同時(shí)還發(fā)現(xiàn)疑似血管瘤和纖維瘤的病變特征。
　　通過以上分子生物學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)技術(shù)的檢測(cè)，結(jié)合臨床癥狀以及病理學(xué)組織切片觀察發(fā)現(xiàn)該分離株(FJAU11W1)的致病特點(diǎn)具有急性轉(zhuǎn)化型ALSV的致病特征，在感染 CEF細(xì)胞中形成疑似病毒顆粒，同時(shí)，病毒核酸序列分析表現(xiàn)