雞柔嫩艾美耳球蟲(chóng)3-1E和CDPK核酸疫苗的研究.pdf

1、雞球蟲(chóng)病是危害養(yǎng)禽業(yè)的一類嚴(yán)重的寄生蟲(chóng)病，雞球蟲(chóng)病的免疫預(yù)防研究越來(lái)越受到人們的重視。雞球蟲(chóng)核酸疫苗以其可誘導(dǎo)產(chǎn)生較強(qiáng)的細(xì)胞免疫反應(yīng)等優(yōu)點(diǎn)成為當(dāng)前研究的熱點(diǎn)，并取得了一定進(jìn)展。為了研究核酸疫苗對(duì)雞球蟲(chóng)感染的防治效果，進(jìn)行了以下試驗(yàn)： 1.球蟲(chóng)子孢子表面抗原基因(3-1E、CDPK)和雞IFN-γ(ChIFN-γ)的亞克隆與表達(dá)：將柔嫩艾美耳球蟲(chóng)(Et)GS株3-1E、CDPK和ChIFN-γ基因亞克隆到pGEX-6P-1表達(dá)載體

2、，構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒pGEX-I、pGEX-E和pGEX-C；分別在其宿主菌BL21進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，得到可溶形式的GST融合蛋白；并將表達(dá)產(chǎn)物通過(guò)GST純化柱進(jìn)行了純化。SDS-PAGE分析表明，表達(dá)產(chǎn)物均占菌體蛋白的30％以上；通過(guò)GST純化柱，獲得了90％以上純度的GST-IFN-γ、GST-3-1E和GST-CDPK融合蛋白。 2.艾美耳球蟲(chóng)3-1E基因、CDPK基因和雞IFN-γ基因的共表達(dá)：利用SOE-PCR技術(shù)將EtGS

3、3-1E基因、EtGSCDPK基因和ChIFN-γ基因兩兩相連、三個(gè)相連成功構(gòu)建了4個(gè)原核共表達(dá)質(zhì)粒pGEX-IE、pMAL-IC、pMAL-EC、pMAL-IEC。將重組質(zhì)粒pGEX-IE在BL21中表達(dá)得到GST-IE融合蛋白；將重組質(zhì)粒pMAL-IC、pMAL-EC、pMAL-IEC在TB1中表達(dá)得到MBP-IC、MBP-EC和MBP-IEC融合蛋白。SDS-PAGE分析表明，表達(dá)的重組蛋白全部為包涵體形式存在，且表達(dá)量均占菌體總

4、表達(dá)量的20％以上；包涵體處理后可得到80％以上純度蛋白。 3.真核表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建及體外表達(dá)檢測(cè)：分別將原核重組質(zhì)粒pGEX-I、pGEX-E、pGEX-C、pGEX-IE、pMAL-IC、pMAL-EC和pMAL-IEC上的單價(jià)、雙價(jià)、三價(jià)基因片段亞克隆到真核表達(dá)載體proVAX中，成功構(gòu)建了單價(jià)、雙價(jià)和三價(jià)的真核重組質(zhì)粒：proI、proE、proC、proIE、proIC、proEC和proIEC等7種。通過(guò)脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑

5、盒將各真核重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染入PK-15細(xì)胞，IFAT試驗(yàn)結(jié)果表明，各真核重組質(zhì)?？稍谡婧思?xì)胞中誘導(dǎo)表達(dá)蛋白。 4.核酸疫苗對(duì)球蟲(chóng)感染雞的保護(hù)研究：雞7日齡用核酸疫苗免疫，14日齡用相應(yīng)核酸疫苗加強(qiáng)免疫或DNAprime-proteinboost免疫組用相應(yīng)重組蛋白加強(qiáng)免疫，二免后7天攻擊5×104個(gè)E.tenellaGS卵囊，7天后殺雞觀察免疫組的保護(hù)效果。采用淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化試驗(yàn)(MTT法)和ELISA對(duì)各試驗(yàn)組進(jìn)行了免疫原性研究。淋

6、轉(zhuǎn)結(jié)果表明，感染后7天，各免疫組T細(xì)胞增殖反應(yīng)顯著，說(shuō)明核酸疫苗具有較強(qiáng)的誘導(dǎo)雞的細(xì)胞免疫反應(yīng)的能力；ELISA結(jié)果表明，蛋白加強(qiáng)免疫組與核酸免疫組相比，誘導(dǎo)產(chǎn)生顯著的血清抗體水平。攻蟲(chóng)感染保護(hù)效果看，與IFN-γ共表達(dá)的雙價(jià)proIE和proIC的保護(hù)效果要優(yōu)于單價(jià)proI、proE和proC，其中proIE組卵囊下降達(dá)到57.73％，說(shuō)明雞IFN-γ具有免疫佐劑功能，但三價(jià)proIEC的效果并不一定優(yōu)于雙價(jià)的效果。在蛋白加強(qiáng)免疫組中