2665.牛腸激酶輕鏈在畢赤酵母中的表達及熱穩(wěn)定性改造

1、牛腸激酶牛腸激酶輕鏈輕鏈在畢赤酵母中的表達在畢赤酵母中的表達及熱穩(wěn)定性改造及熱穩(wěn)定性改造ProductionEngineeringThermostabilityofBovineEnterokinaselightchain(BEKL)inPichiapastis學科專業(yè)：生物工程研究生：郭超指導教師：甘一如教授企業(yè)導師：王大梅教授級高工天津大學化工學院二零一六年五月摘要摘要腸激酶（EnterokinaseEK）是存在于哺乳動物十二指腸內的

2、一種異源二聚體絲氨酸蛋白酶。由于其酶切的高度特異性，酶解后可保證目的蛋白N末端氨基酸序列的完整性，從而使得腸激酶成為基因工程領域融合蛋白表達后修飾的首選工具酶之一。本研究通過基因工程手段，成功構建了重組牛腸激酶載體pPIC9KBEKL。經(jīng)G418抗性梯度篩選獲得了5株不同抗性水平的菌株并借助QPCR技術，對其基因拷貝數(shù)進行了鑒定，結果顯示菌株抗性水平及腸激酶表達量與外源基因拷貝數(shù)呈正相關。隨后，采用多因素優(yōu)選法對篩選所得的菌株進行了表達

3、條件優(yōu)化，并利用鎳離子親和層析的方法對發(fā)酵產(chǎn)物進行分離純化。結果顯示，經(jīng)畢赤酵母表達所得的重組型牛腸激酶分子量約為43kDa，糖基化程度約為20.9%。純化后，每1L發(fā)酵液獲得5.7mg具有活性的目的蛋白，采用切割融合蛋白的方法測定純化后牛腸激酶的比活達1.25103Umg，動力學常數(shù)Km=0.59mM，kcat=45.1S1。以牛腸激酶輕鏈作為研究對象，嘗試利用理性設計的方法以提高其熱穩(wěn)定性。首先綜合Gromas4.5.5、BFact

4、及FlexService等不同考評蛋白柔性區(qū)軟件的分析結果，確定出腸激酶的結構靈活區(qū)Fragment6369，F(xiàn)ragment8593及Fragment135139，并通過添加脯氨酸或二硫鍵的方法來對蛋白的靈活區(qū)進行剛化。根據(jù)β轉角內序列統(tǒng)計信息及引入位置原有的殘基不參與形成氫鍵的原則確定了三株脯氨酸突變體S67P，R87P及Y136P。結合腸激酶結構信息及DisulfidebyDesign軟件預測結果，確定了三株添加二硫鍵突變體：C5

5、C146，C85C88及C73C98。利用Quickchange定點突變的方法引入突變位點，并通過在畢赤酵母中表達成功獲得了6種不同突變體蛋白。在對野生型及突變型牛腸激酶的熱穩(wěn)定性測定后發(fā)現(xiàn)，添加二硫鍵后的突變體（C5C146，C85C88及C73C98）及脯氨酸突變體（R87P），其失活半衰期（t12）和半失活溫度（T5010）較野生型均有了顯著提高。同時，對R87P及C85C88突變體酶活測定結果表明，突變體酶催化效率（Kmkcat