納豆激酶基因密碼子優(yōu)化設(shè)計(jì)與合成及在畢赤酵母中的高效表達(dá).pdf

1、納豆激酶（Nattokinase，NK）是由納豆枯草桿菌（Bacillus subtilis var.natto）產(chǎn)生的一種具有較強(qiáng)溶栓功能的絲氨酸蛋白酶。國(guó)內(nèi)外研究表明，該酶能顯著溶解體內(nèi)外血栓，明顯縮短纖維蛋白的溶解時(shí)間，并具有激活靜脈內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生組織型纖溶酶原激活劑（t-PA），降解和失活纖溶酶原激活劑的抑制劑（pAI-1）等功能。納豆激酶的溶解血栓功效已得到廣泛確證，但目前還沒有能夠得到很好推廣利用，應(yīng)用很有限，其原因是市場(chǎng)供給

2、不足以及價(jià)格高。利用高效表達(dá)系統(tǒng)作為生物反應(yīng)器，可低成本、規(guī)?；卮罅可a(chǎn)納豆激酶供更多人所用，無(wú)疑是解決這一問(wèn)題的有效方法之一。
　　 本研究應(yīng)用基因工程和蛋白質(zhì)工程技術(shù)獲得具有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的納豆激酶高產(chǎn)工程菌，為納豆激酶作為溶栓藥物的進(jìn)一步研制和開發(fā)應(yīng)用提供理論依據(jù)和條件，主要工作包括以下內(nèi)容：
　　 1.從本課題組自主分離篩選的原生質(zhì)體紫外誘變處理后產(chǎn)酶提高幅度最大的納豆菌誘變株Du115和野生納豆菌BN10基因組

3、DNA中擴(kuò)增納豆激酶成熟肽基因nkD和nkB，構(gòu)建重組表達(dá)載體pPICZα-A-nkD和pPICZα-A-nkB，DNA序列測(cè)定表明，nkD基因與nkB基因相比，有兩處核苷酸發(fā)生了突變（A107G以及C396T），A107G堿基突變導(dǎo)致氨基酸的替代D36G（Asp-Gly）。將兩重組表達(dá)載體經(jīng)SacI線性化后電擊轉(zhuǎn)化畢赤酵母X-33并實(shí)現(xiàn)了分泌表達(dá)，對(duì)表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行分離純化、酶活性測(cè)定及熱穩(wěn)定性檢測(cè)。結(jié)果表明，納豆激酶DNK與BNK在65

4、℃處理15min，前者的熱穩(wěn)定性提高20％，比活力提高16.6％。對(duì)位點(diǎn)變化前后的納豆激酶空間結(jié)構(gòu)進(jìn)行比較預(yù)測(cè)，由此可推斷，第36位氨基酸殘基的突變可能與其酶熱穩(wěn)定性及活性提高密切有關(guān)。綜合考慮，選擇納豆菌Du115納豆激酶基因作為下一步研究的材料。
　　 2.在不改變納豆激酶DNK氨基酸序列的基礎(chǔ)上，優(yōu)先選擇畢赤酵母最偏愛的密碼子，并參照原有納豆菌DU115納豆激酶基因的密碼子使用情況，部分使用次偏好密碼子，從而盡量消除mRN

5、A穩(wěn)定的二級(jí)結(jié)構(gòu)，設(shè)計(jì)并合成了納豆激酶成熟肽基因（synkD）。所合成的synkD全長(zhǎng)為848 bp，克隆入pMD18-T載體上，測(cè)序結(jié)果表明與預(yù)期結(jié)果相一致。
　　 3.將人工合成的納豆激酶基因synkD克隆入pPICZα-A質(zhì)粒，構(gòu)建分泌型重組酵母表達(dá)載體pPICZα-A-synkD，轉(zhuǎn)化畢赤酵母X-33得到重組子，改造后的synkD表達(dá)水平比nkD高3.5倍。對(duì)重組蛋白的表達(dá)條件進(jìn)行了優(yōu)化，結(jié)果表明：當(dāng)重組酵母菌在BMGY