重組甲狀旁腺激素在畢赤酵母中的分泌表達(dá)及條件優(yōu)化.pdf

1、甲狀旁腺激素（parathyroid hormone）是保持體內(nèi)血鈣及磷酸鹽平衡的主要調(diào)節(jié)因子，由甲狀旁腺的主細(xì)胞產(chǎn)生，其主要的靶器官是骨骼、小腸和腎臟。臨床上用于治療骨骼類疾病，如：低甲狀腺血癥、骨質(zhì)疏松癥等。采用基因工程的方法生產(chǎn)PTH是低成本獲得髙質(zhì)量產(chǎn)品的一種途徑，已有研究探索了通過(guò)在大腸桿菌中表達(dá)hPTH蛋白的技術(shù)，但在真核細(xì)胞中獲取hPTH的研究則尚少見(jiàn)報(bào)道。畢赤酵母（Pichia pastoris）是表達(dá)外源蛋白理想的真核

2、表達(dá)系統(tǒng)之一，具有嚴(yán)格調(diào)控外源蛋白的表達(dá)、加工修飾表達(dá)產(chǎn)物、表達(dá)量高、營(yíng)養(yǎng)要求低等優(yōu)點(diǎn)。
　　本研究旨在構(gòu)建hPTH的酵母表達(dá)體系以獲得更接近人體生理活性的真核表達(dá)產(chǎn)品，同時(shí)開(kāi)展表達(dá)條件優(yōu)化以摸索發(fā)酵生產(chǎn)的條件。實(shí)驗(yàn)中采用PCR方法擴(kuò)增出hPTH基因，用限制性內(nèi)切酶SnaBⅠ和NotⅠ雙酶切hPTH基因和載體pPIC9K，回收純化后以T4連接酶連接，構(gòu)建表達(dá)載體pPIC9K-hPTH。經(jīng)限制性內(nèi)切酶SacI線性化后，用電轉(zhuǎn)化的方法

3、將表達(dá)質(zhì)粒pPIC9K-hPTH導(dǎo)入畢赤酵母GS115。轉(zhuǎn)化株通過(guò)G418篩選、MM－MD平板篩選和菌落PCR鑒定，獲得了含有目的基因的陽(yáng)性重組菌株，命名為GS115/pPIC9K-hPTH。將重組菌株在含1％甲醇的BMMY中進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，通過(guò)SDS-PAGE法對(duì)表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行分析，結(jié)果表明，hPTH基因在畢赤酵母中成功獲得表達(dá)，表達(dá)蛋白的分子量約9.5KD。在搖瓶培養(yǎng)條件下，初步優(yōu)化了甲醇誘導(dǎo)時(shí)間、甲醇誘導(dǎo)濃度、蛋白酶抑制劑EDTA等對(duì)