中華水蛇PLIγ在畢赤酵母中的表達、純化及活性測定.pdf

1、磷脂酶 A2是一類可催化細胞膜和脂蛋白磷脂二位?；⊿n-2）水解，釋放溶血磷脂及游離脂肪酸的酶族，從而參與人體花生四烯酸通路，進一步的產生大量的炎癥因子，造成機體損傷。磷脂酶 A2在生物個體中分布廣泛，在多種蛇類蛇毒中已發(fā)現(xiàn)多種類型的PLA2，含量豐富，毒性多樣，表現(xiàn)出細胞毒性、神經毒性、肌肉毒性以及出血毒性等多種毒性，可以作為開發(fā)抗蛇毒藥物的關鍵靶點。據研究發(fā)現(xiàn)，一些種類的蛇的肝臟可以表達一種蛋白質，可以特異性中和蛇毒組分 PLA2

2、，從而保護自己不被自身毒液所傷害，這種蛋白稱為 PLA2抑制劑（ phospholipase A2 inhibitors, PLI）。實驗室前期研究中，我們從中華水蛇血清中純化得到一個新PLIγ，它對五步蛇svPLA2酶活性和出血毒均有強抑制效果。由于蛇資源缺乏且血量較少，從中提取大量 PLI較為困難，實驗室前期構建中華水蛇PLIγ原核表達系統(tǒng)，但蛋白以沒有生物活性的包涵體形式存在，復性效率低，對其酶活有所影響，故將采用真核表達方式得到

3、中華水蛇PLIγ。
　　目的：
　　為更加方便快捷的得到活性更高的中華水蛇PLIγ蛋白，構建pPICZαA-PLIγ重組表達載體，轉化進畢赤酵母中進行真核表達，進一步的進行活性測定，為開發(fā)新型抗蛇毒藥物奠定基礎。
　　方法：
　　采用瓊脂糖活性平板實驗，根據形成透明圈的面積，檢測中華水蛇血清PLIγ對3種蛇毒酶活的抑制活性；分別向小鼠皮下注射3種蛇毒粗毒，造成小鼠皮下出血形成血斑，注射天然血清與蛇毒混合溶液，比較

4、出血斑的大小，從而證明中華水蛇天然PLIγ的廣譜抗蛇毒作用。
　　設計分別帶有EcoR I和Not I酶切位點的上下游引物，對實驗室前期構建的原核表達載體pET28c(+)-PLIγ進行擴增，從而得到全長為570 bp的PLIγ基因，經雙酶切之后，連接至酵母表達載體pPICZαA上，轉化至DH5α中進行擴增。設置參數(shù)1.5 KV，25μF，電轉時間5 ms，將線性化后pPICZαA-PLIγ重組質粒，電轉化至畢赤酵母 GS115中

5、，利用博來霉素篩選陽性克隆。提取陽性克隆酵母DNA，利用PCR進行鑒定。在30℃、250 rpm條件下，使用終濃度0.5％甲醇對篩選的轉化子進行誘導，連續(xù)培養(yǎng)120 h，每隔24 h收集發(fā)酵液上清， western bolt使用anti-His抗體檢測目的蛋白PLIγ表達效果，確定最佳誘導時間。
　　采用鎳柱親和層析分離純化 PLIγ，SDS-PAGE檢測純度。使用瓊脂糖平板法檢測PLIγ對五步蛇毒粗毒酶活的抑制作用，測量透明圈直

6、徑，計算抑制率。利用小鼠皮下注射實驗，對比血斑面積，檢測PLIγ對五步蛇粗毒的出血毒性抑制效果。
　　結果：
　　在針對五步蛇毒和蝮蛇蛇毒的瓊脂糖平板實驗中，中華水蛇PLIγ實驗組透明圈直徑減小。在眼鏡蛇粗毒組，中華水蛇PLIγ實驗組與陽性對照組相比，透明圈直徑無明顯變化。在小鼠皮下注射實驗中，注射中華水蛇PLIγ蛋白致使五步蛇毒和蝮蛇毒的造成的出血斑的面積減小。在眼鏡蛇毒組，注射中華水蛇PLIγ蛋白使小鼠的存活時間延長0.

7、5-1 h。
　　成功從pET28c(+)-PLIγ質粒克隆得到目的基因，長度為570 bp，并經過雙酶切構建pPICZαA-PLIγ重組質粒，經過測序發(fā)現(xiàn)PLIγ基因沒有發(fā)生任何突變。重組質粒經ScaI酶線性化，成功電轉至酵母GS115細胞中，在含博來霉素平板上長出菌落，PCR鑒定其為陽性轉化子。甲醇誘導，取發(fā)酵液上清，通過western bolt檢測到目的蛋白PLIγ的表達，在23 kDa左右處出現(xiàn)條帶，并在培養(yǎng)時間為72 h

8、時蛋白表達量最多。發(fā)酵液經親和層析分離純化后，SDS-PAGE檢測得到單一PLIγ蛋白條帶。瓊脂糖活性平板實驗中，PLIγ使透明圈面積減小，對五步蛇毒酶活的抑制效率為84%。五步蛇毒小鼠背部出血試驗中， PLIγ顯著改善血管破損癥狀，出血斑面積減小。
　　結論：
　　中華水蛇PLIγ對蛇毒粗毒的酶活性和出血毒性、神經毒性有較好抑制效果，具有廣譜抗蛇毒作用。pPICZαA-PLIγ重組質粒在酵母GS115細胞中，可被甲醇誘導產