2023年全國碩士研究生考試考研英語一試題真題(含答案詳解+作文范文)_第1頁
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文檔簡介

1、纖維素酶是將纖維素水解為葡萄糖的一組酶的總稱,它主要包括外切-β-葡聚糖酶、內(nèi)切-β-葡聚糖酶和β-葡萄糖苷酶等三種組分。在目前最常用的里氏木霉(Trichoderma reesei)纖維素酶系中,雖然外切-β-葡聚糖酶含量較高,占總分泌酶蛋白的60%左右,但內(nèi)切-β-葡聚糖酶活力不足,影響了纖維素酶對纖維素底物的協(xié)同降解效率。采用基因重組技術(shù),對里氏木霉進行定向進化,實現(xiàn)內(nèi)切-β-葡聚糖酶基因的高效表達,對于提高纖維素酶的生產(chǎn)水平,促

2、進其在生物質(zhì)能源和棉織物水洗整理等領域中的工業(yè)化應用具有重要意義。
  本文首先研究了內(nèi)切-β-葡聚糖酶基因egl2在里氏木霉中的同源表達。通過RT-PCR法克隆得到里氏木霉內(nèi)切-β-葡聚糖酶基因egl2,將該基因置于纖維二糖水解酶Ⅰ基因啟動子及信號肽序列(Pcbh1-ss)和纖維二糖水解酶Ⅰ基因終止子序列(Tcbh1)之間,構(gòu)建得到含里氏木霉內(nèi)切-β-葡聚糖酶基因egl2表達盒和潮霉素篩選標記的表達載體pCB-PHT。采用根癌農(nóng)

3、桿菌介導轉(zhuǎn)化法,將表達載體pCB-PHT導入里氏木霉分生孢子。研究確定了適宜的轉(zhuǎn)化條件為:分生孢子濃度為107個/ml、農(nóng)桿菌培養(yǎng)至吸光值0.8(OD660)、液體誘導培養(yǎng)基pH值5.3、共培養(yǎng)溫度為24℃。通過根癌農(nóng)桿菌介導轉(zhuǎn)化得到241株里氏木霉轉(zhuǎn)化子,進一步在以CMC為唯一碳源的平板上進行初篩,得到6株生長較快的轉(zhuǎn)化子。通過搖瓶產(chǎn)酶試驗復篩,獲得了一個優(yōu)良重組里氏木霉轉(zhuǎn)化子E5,該菌株在發(fā)酵120h后內(nèi)切-β-葡聚糖酶活力可高達3

4、472 U/ml,是出發(fā)菌株ZU-02同期酶活的3.8倍。同時,重組里氏木霉轉(zhuǎn)化子的纖維素酶總活力(濾紙酶活力)也提高了32%。該項研究成果在植物纖維原料的生物煉制及生物質(zhì)能源產(chǎn)業(yè)化進程中將可發(fā)揮重要作用。
  進一步研究了特異腐質(zhì)霉內(nèi)切-β-葡聚糖酶基因cel5A在里氏木霉中的異源表達。采用RT-PCR法,從特異腐質(zhì)霉中克隆得到內(nèi)切-β-葡聚糖酶基因cel5A,其長度為1116bp,編碼372個氨基酸殘基。將該基因置于Pcbh1

5、-ss和Tcbh1之間,進一步構(gòu)建得到含特異腐質(zhì)霉cel5A基因表達盒和潮霉素篩選抗性標記的載體pCB-HI。通過根癌農(nóng)桿菌介導轉(zhuǎn)化得到323株里氏木霉轉(zhuǎn)化子,進一步在以 CMC為唯一碳源的平板上進行初篩,得到8個生長較快的轉(zhuǎn)化子。對8株里氏木霉轉(zhuǎn)化子進行搖瓶產(chǎn)酶篩選,獲得了優(yōu)良里氏木霉重組菌株H3。采用SDS-PAGE檢測重組里氏木霉H3的發(fā)酵液,獲得了來自特異腐質(zhì)霉內(nèi)切-β-葡聚糖酶的蛋白條帶(約52 kDa)。該菌株表達的內(nèi)切-β

6、-葡聚糖酶在pH6.0時活性最高,在pH5.0-7.0范圍內(nèi)有明顯的催化活性。
  對重組里氏木霉H3的發(fā)酵性能進行了研究,發(fā)現(xiàn)碳源對內(nèi)切-β-葡聚糖酶的形成有重要影響,當采用乳糖與微晶纖維素的復合碳源時,酶活力和產(chǎn)率都可明顯提高。利用玉米漿粉作為氮源,其適宜濃度為12g/L。培養(yǎng)基初始pH值對發(fā)酵酶活力及產(chǎn)率有一定影響,適宜的初始pH值為5.0。重組里氏木霉H3搖瓶條件下發(fā)酵120h,其中性內(nèi)切-β-葡聚糖酶活力為3724 U/

7、mL。在2M3的發(fā)酵罐進行產(chǎn)酶試驗,由于溶氧環(huán)境和營養(yǎng)物質(zhì)傳遞的改善,發(fā)酵96h中性內(nèi)切-β-葡聚糖酶活力可高達8012 U/mL。
  纖維素酶的分子結(jié)構(gòu)可分為纖維素結(jié)合區(qū)(CBD)、連接橋和催化結(jié)構(gòu)域三部分。為研究里氏木霉內(nèi)切-β-葡聚糖酶基因egl2的CBD基因片段對特異腐質(zhì)霉cel5A的影響,克隆得到里氏木霉內(nèi)切-β-葡聚糖酶基因egl2的CBD基因序列,將其連接到特異腐質(zhì)霉內(nèi)切-β-葡聚糖酶基因上,進一步構(gòu)建得到含啟動子

8、Pcbh1和潮霉素抗性標記的載體pCB-CEG。將載體pCB-CEG用根癌農(nóng)桿菌介導轉(zhuǎn)化法導入里氏木霉,通過轉(zhuǎn)化得到260株轉(zhuǎn)化子。將轉(zhuǎn)化子在以CMC為唯一碳源的平板上初篩,得到7株生長較快的重組菌株。搖瓶產(chǎn)酶篩選后獲得重組里氏木霉HC4,該菌株在發(fā)酵120 h后內(nèi)切-β-葡聚糖酶活力為3254 U/ml。酶學性質(zhì)研究結(jié)果表明:重組里氏木霉HC4所產(chǎn)內(nèi)切-β-葡聚糖酶的作用pH范圍更寬(在pH5.0-7.5范圍內(nèi)有明顯的催化活性),其最

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