腎上腺髓質(zhì)素對LPS抑制人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞TFPI基因表達(dá)的影響及其分子機(jī)制.pdf

1、本研究旨在觀察ADM對LPS抑制的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(Human umbilical vein endothelial cells，HUVECs)組織因子途徑抑制物(Tissue factor pathway inhibitor，TFPI)(機(jī)體內(nèi)的主要抗凝因子)表達(dá)的作用，并進(jìn)一步闡明這種效應(yīng)的分子機(jī)制。 研究內(nèi)容與方法：以體外原代培養(yǎng)的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(Human umbilical vein endothelialcells

2、，HUVECs)作為靶細(xì)胞，主要采用下述實(shí)驗(yàn)方法進(jìn)行了四個(gè)方面的研究： 一.ADM和/或LPS對：HUVECs TFPI基因表達(dá)的影響。 1.HUVECs分離、培養(yǎng)及鑒定； 2.采用發(fā)色底物法檢測HUVECs培養(yǎng)液中TFPI的蛋白活性，選擇ADM、LPS的最佳作用時(shí)間和濃度，觀察ADM在LPS存在條件下對HUVECs TFPI表達(dá)活性的影響； 3.應(yīng)用RT-PCR技術(shù)分析ADM在LPS存在條件下對HUVE

3、Cs TFPI mRNA表達(dá)水平的影響。 二.ADM拮抗LPS抑制HUVECs TFPI基因表達(dá)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑。 1.采用促分裂原活化蛋白激酶激酶MAPKK(Mitogen-activated protein kinasekinase)特異性抑制劑PD98059觀察MAPK途徑在ADM拮抗LPS抑制的HUVECs TFPI表達(dá)中的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)作用； 2.采用蛋白激酶C(Protein kinase C，PKC)抑制劑

4、H7和Staurosporine觀察PKC途徑在ADM拮抗LPS抑制的HUVECs TFPI表達(dá)中的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)作用； 3.采用cAMP抑制劑Rp.isomer-8.bromo.cAMP(簡稱Rp-cAMP)及其類似物8-bromo-cAMP觀察cAMP途徑在ADM拮抗LPS抑制的HUVECs TFPI表達(dá)中的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)作用； 4.采用激光共聚焦顯微鏡技術(shù)(Laser-scanning confocal microscope)

5、，觀察在ADM、LPS作用下單個(gè)HUVEC胞內(nèi)鈣離子水平的變化，并輔以鈣離子拮抗劑Amlodipine，探討鈣離子信號途徑在ADM拮抗LPS抑制的HUVECs TFPI表達(dá)中的作用。 三.核轉(zhuǎn)錄因子GATA-2、SP1和c-Mye在HUVECs TFPI基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控中的作用。 1.應(yīng)用EMSA和超遷移(Super Shift)實(shí)驗(yàn)，觀察ADM和/或LPS對TFPI基因表達(dá)相關(guān)核轉(zhuǎn)錄因子GATA-2、SP1和c-Myc與其

6、相應(yīng)的順式作用元件結(jié)合活性的影響； 2.采用Western Blot雜交技術(shù)，觀察ADM和/或LPS對TFPI基因表達(dá)相關(guān)的核轉(zhuǎn)錄因子GATA-2、SP1和c-Myc水平的影響。 四.TFPI基因5，上游不同長度啟動(dòng)子區(qū)中GATA-2、SP1和c-Myc調(diào)節(jié)元件在HUVECs TFPI基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控中的作用。 1.采用PCR和基因重組技術(shù)，構(gòu)建含人TFPI基因5'上游不同長度調(diào)控序列的熒光素酶報(bào)告基因質(zhì)粒；

7、 2.應(yīng)用真核基因轉(zhuǎn)染技術(shù)，分析TFPI基因5'上游不同長度調(diào)控序列在ADM拮抗LPS抑制的HUVECs TFPI基因轉(zhuǎn)錄中的調(diào)控作用； 3.采用重疊延伸特異位點(diǎn)誘變法，構(gòu)建含人TFPI基因5'上游-1247bp至-381bp序列之間GATA-2和SP1順式作用元件定點(diǎn)突變序列的熒光素酶報(bào)告基因質(zhì)粒： 4.應(yīng)用真核基因轉(zhuǎn)染技術(shù)，分析TFPI基因5'上游GATA-2和SP1順式作用元件在ADM拮抗LPS抑制的HUVECs

8、TFPI基因轉(zhuǎn)錄中的作用。 研究結(jié)果： 1.本研究中，ADM呈濃度和時(shí)間依賴性地誘導(dǎo)HUVECs中TFPI的蛋白活性和mRNA的表達(dá)，LPS的作用則相反，呈劑量依賴性地抑制HUVECs TFPI的蛋白表達(dá)，ADM可以拮抗LPS所致TFPI表達(dá)的降低。 2.MAPKK抑制劑PD98059以及cAMP抑制劑Rp.cAMP均顯著抑制ADM對LPS影響TFPI表達(dá)的拮抗作用；cAMP類似物8-bromo-cAMP可直接上

9、調(diào)LPS抑制的TFPI的表達(dá)。 3.PKC抑制劑H7和Staurosporine對ADM拮抗LPS抑制TFPI表達(dá)的作用無顯著影響。 4.激光掃描共聚焦顯微鏡觀察顯示，ADM使單個(gè)HUVEC胞內(nèi)游離鈣離子濃度([Ca<'2+>]i)緩慢平穩(wěn)地下降，而LPS可使胞內(nèi)游離鈣離子濃度([Ca<'2+>]i)迅速短暫地增加，預(yù)先給與HUVEC ADM后，LPS所致鈣離子濃度([Ca<'2+>]i)的增加程度和速度顯著下降；鈣離子

10、抑制劑Amlodipine可上調(diào)LPS所致TFPI表達(dá)的下降。 5.EMSA和Super Shift實(shí)驗(yàn)證實(shí)，TFPI表達(dá)相關(guān)的核轉(zhuǎn)錄因子GATA-2、SP1和c-Myc可以與其相應(yīng)的GATA-2、SP1和c-Myc調(diào)節(jié)元件發(fā)生特異性結(jié)合：在ADM作用下，核轉(zhuǎn)錄因子GATA-2和SP1與其相應(yīng)調(diào)節(jié)元件的結(jié)合活性增加，LPS則使其結(jié)合活性下降，ADM對LPS所致結(jié)合活性的下降具有拮抗作用。核轉(zhuǎn)錄因子c-Myc與其調(diào)節(jié)元件的結(jié)合活性

11、則無顯著變化。 6.Western Blot雜交結(jié)果顯示，ADM可顯著增加HUVECs胞內(nèi)核轉(zhuǎn)錄因子GATA-2、SP1的蛋白含量，相反，LPS則降低GATA-2和SP1的蛋白含量，ADM可拮抗LPS的作用；核轉(zhuǎn)錄因子c-Myc的蛋白含量則無顯著變化。 7.瞬時(shí)轉(zhuǎn)染分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，TFPI基因5’上游啟動(dòng)子區(qū)-1247bp和-381bp之間的序列在ADM和/或LPS調(diào)節(jié)熒光素酶的表達(dá)中具有重要作用，此間序列內(nèi)含有3個(gè)G

12、ATA-2和1個(gè)SP1調(diào)節(jié)元件。 8.定點(diǎn)突變實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，上述3個(gè)GATA-2和1個(gè)SP1調(diào)節(jié)元件的突變均使LPS抑制的熒光素酶表達(dá)活性增加，ADM對LPS的拮抗作用也下降；此外，GATA-2調(diào)控序列的突變可使HUVECs基礎(chǔ)熒光素酶表達(dá)活性下降，而SP1的突變則對熒光素酶的基礎(chǔ)表達(dá)活性無明顯影響。 研究結(jié)論： 本研究結(jié)果表明，ADM可以通過cAMP、MAPK和鈣離子信號途徑拮抗LPS對HUVECs TFPI表