人參皂甙Rb1對(duì)大鼠局灶性腦缺血腦組織GDNF mRNA與蛋白表達(dá)的影響.pdf

1、目的：已有的研究表明人參皂甙Rb1對(duì)缺血性腦損傷具有神經(jīng)保護(hù)作用，但這種神經(jīng)保護(hù)作用機(jī)制尚不清楚，故本實(shí)驗(yàn)探討人參皂甙Rb1神經(jīng)保護(hù)作用是否通過增加膠質(zhì)細(xì)胞源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(GDNF)的表達(dá)而促進(jìn)神經(jīng)組織的修復(fù)。 方法:Wistar健康成年大鼠250-300克；雌雄不限，大鼠腦缺血模型成功后隨機(jī)分為兩組：人參皂甙Rb1給藥組[再灌注后立即腹腔注射人參皂甙Rb1(40mg/kg)]與單純腦缺血再灌注組。正常組大鼠、假手術(shù)組各5只作

2、為對(duì)照組。線栓法阻斷大鼠大腦中動(dòng)脈(middlecerebralartery,MCA)2小時(shí)后，分別再灌注3小時(shí)，12小時(shí)，1天，2天，3天，5天制備成各時(shí)間組，每組5只。在各時(shí)間點(diǎn)過量麻醉處死動(dòng)物，經(jīng)心灌注固定，取出腦組織制成石蠟切片或在各時(shí)間點(diǎn)過量麻醉，斷頭取腦組織放入-80℃保存，備用。逆轉(zhuǎn)錄—聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)測(cè)定GDNFmRNA水平的變化，免疫組織化.學(xué)(immunohistochemistry,IHC)染色觀察GD

3、NF蛋白表達(dá)的改變及分布的特點(diǎn)。 結(jié)果：正常組與假手術(shù)組皮質(zhì)區(qū)廣泛的GDNF(+)細(xì)胞，在其它腦區(qū)有較多的GDNF(+)～(++)細(xì)胞。單純腦缺血再灌注組：再灌注三小時(shí)，額頂皮質(zhì)缺血周邊區(qū)廣泛GDNF(++)的細(xì)胞，紋狀體缺血周邊區(qū)有一些GDNF(++)細(xì)胞，同側(cè)下丘腦可見到少量GDNF弱陽性細(xì)胞。再灌注12小時(shí)，額項(xiàng)皮質(zhì)缺血周邊區(qū)有一些GDNF(++)細(xì)胞，紋狀體缺血周邊區(qū)零星散在的GDNF(+)細(xì)胞。同側(cè)下丘腦未見到GDNF

4、陽性細(xì)胞。再灌注1天，GDNF(+)細(xì)胞僅存在于額項(xiàng)皮質(zhì)缺血周邊區(qū)，紋狀體、下丘腦缺血周邊區(qū)均未見到GDNF陽性細(xì)胞。再灌注2天，額頂皮質(zhì)缺血周邊區(qū)內(nèi)彌漫分布著大量的GDNF(++)的細(xì)胞。紋狀體、下丘腦缺血周邊區(qū)可見少許GDNF(+)的細(xì)胞。再灌注3天，額頂皮質(zhì)缺血周邊區(qū)GDNF陽性細(xì)胞數(shù)量明顯減少；紋狀體缺血周邊區(qū)有少量GDNF(+)的細(xì)胞。再灌注5天，缺血側(cè)紋狀體與下丘腦無GDNF陽性細(xì)胞，額頂皮質(zhì)缺血周邊區(qū)有散在少量GDNF弱陽

5、性的細(xì)胞。整個(gè)再灌注過程中，GDNF陽性細(xì)胞數(shù)在3小時(shí)升高，12h與1d降低，2天又升高，隨后下降。各時(shí)間點(diǎn)GDNF陽性細(xì)胞數(shù)同2天組比較，差異具有顯著性(P＜0.01)。在人參皂甙Rb1給藥組，與單純腦缺血再灌注組同時(shí)間點(diǎn)比較，再灌注3小時(shí)額頂皮質(zhì)缺血周邊區(qū)GDNF的陽性細(xì)胞數(shù)增多，染色增強(qiáng)。下丘腦偶見數(shù)個(gè)GDNF弱陽性的細(xì)胞。再灌注12小時(shí)額項(xiàng)皮質(zhì)、紋狀體缺血周邊區(qū)GDNF的陽性細(xì)胞數(shù)繼續(xù)增多，染色增強(qiáng)，且同側(cè)下丘腦有較多的GDNF

6、弱陽性的細(xì)胞。再灌注1天，GDNF強(qiáng)陽性細(xì)胞數(shù)增多，主要位于視前區(qū)、紋狀體缺血周邊區(qū)。再灌注2天，額項(xiàng)皮質(zhì)缺血周邊區(qū)GDNF強(qiáng)陽性細(xì)胞數(shù)明顯增多、染色增強(qiáng)。紋狀體、海馬、視前區(qū)、皮質(zhì)杏仁核也有較多的GDNF中等陽性的細(xì)胞。再灌注3天，GDNF陽性細(xì)胞數(shù)增多，主要位于額項(xiàng)皮質(zhì)缺血周邊區(qū)，但染色無變化。再灌注5天，GDNF陽性細(xì)胞數(shù)主要集中于雙側(cè)皮質(zhì)，染色呈強(qiáng)陽性。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析顯示，人參皂甙Rb1給藥組，GDNF陽性細(xì)胞數(shù)在各時(shí)間點(diǎn)顯著高于單

7、純腦缺血再灌注組(P＜0.01)。RT-PCR的實(shí)驗(yàn)顯示，從凝膠上cDNA的亮度判斷，在單純腦缺血再灌注組，在3小時(shí)與2天組GDNFmRNA的.表達(dá)強(qiáng)于其它各時(shí)間點(diǎn)；在人參皂甙Rb1給藥組，48小時(shí)GDNFmRNA的表達(dá)強(qiáng)于其它各時(shí)間點(diǎn)。在人參皂甙Rb1給藥組和單純腦缺血再灌注組相比，從cDNA的亮度上看無明顯差異。 結(jié)論：1.腦缺血再灌注損傷后GDNFmRNA與蛋白表達(dá)在3小時(shí)與2天分別有兩個(gè)高峰。給予人參皂甙Rb1后，GDN

8、FmRNA與蛋白表達(dá)在2天達(dá)高峰。 2.單純腦缺血再灌注組和人參皂甙Rb1給藥組，GDNF陽性細(xì)胞數(shù)主要分布于額頂皮質(zhì)缺血周邊區(qū)，其次為紋狀體缺血周邊區(qū)，缺血側(cè)下丘腦偶見到數(shù)個(gè)GDNF陽性細(xì)胞。 3.根據(jù)兩組間GDNF免疫組織化學(xué)(immunohistochemistry,IHC)染色強(qiáng)弱比較，給予人參皂甙Rb1后，在同一時(shí)間點(diǎn)，同一缺血周邊區(qū)GDNF陽性細(xì)胞數(shù)染色增強(qiáng)。對(duì)GDNF陽性細(xì)胞數(shù)統(tǒng)計(jì)分析顯示，人參皂甙Rb1給