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文檔簡介
1、目的:觀察人參皂甙Rb1(GRb1)對馬桑內(nèi)酯(CL)所致大鼠癲癇的作用,建立大鼠海馬組織蛋白質(zhì)分離的雙向電泳(2-DE)技術(shù)體系,獲得可能與CL癲癇發(fā)作及GRb1神經(jīng)保護(hù)作用有關(guān)的蛋白質(zhì)成分,探討海馬組織蛋白質(zhì)在癲癇發(fā)生發(fā)展過程中的作用和地位以及GRb1對其的影響。 方法:選取雄性成年SD大鼠18只,隨機(jī)均分為3組:對照組、CL致癇組和GRbl+CL致癇組。GRbl+CL致癇組大鼠用GRb1(1.5mg/ml,30mg/kg)
2、每天灌胃1次,連續(xù)3天,第4天腹腔注射CL(1mg/ml,4mg/kg),觀察其行為學(xué)改變。自腹腔注射CL后開始計(jì)時(shí),3小時(shí)后行大鼠腦組織取材。CL致癇組除實(shí)驗(yàn)前3天用等量生理鹽水灌胃外,余處理同GRb1+CL致癇組。對照組除實(shí)驗(yàn)日腹腔注射等量生理鹽水外,余處理同CL致癇組。各組取半數(shù)動物,用2%戊巴比妥鈉麻醉后,開胸暴露心臟,經(jīng)左心室用150ml-200ml的生理鹽水快速灌注沖洗,繼以400 ml4%多聚甲醛灌注固定,隨后開顱取腦組織
3、置于4%多聚甲醛中后固定過夜,常規(guī)脫水、透明、浸蠟、包埋。石蠟切片常規(guī)脫蠟,HE染色,普通光學(xué)顯微鏡下觀察海馬神經(jīng)元的組織學(xué)改變。各組其余半數(shù)動物,斷頭處死并剝離其海馬組織,-80℃保存?zhèn)溆?。海馬組織采用常規(guī)的組織裂解法冰上裂解,提取海馬組織蛋白,Bradford法測定蛋白質(zhì)含量,雙向電泳分離蛋白質(zhì)。第一向采用pH4-7的固相pH梯度(IPG)等電聚焦,第二向采用濃度為10%的十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE),獲得
4、的凝膠進(jìn)行銀染并經(jīng)凝膠成像系統(tǒng)采集獲得雙向電泳圖譜,根據(jù)IPG膠條的等電點(diǎn)(pI)線性梯度和標(biāo)準(zhǔn)分子量Marker,確定蛋白質(zhì)斑點(diǎn)的pI和分子量(MW),用Image Master2DE Platinum5.0圖像分析軟件進(jìn)行蛋白質(zhì)電泳圖譜差異分析,以GRb1+CL致癇組凝膠作為參考膠分別與對照組和CL致癇組凝膠進(jìn)行蛋白斑點(diǎn)匹配,分別在CL致癇組和GRb1+CL致癇組初步篩選出相對灰度值變化較大的蛋白質(zhì)斑點(diǎn)共6個。切取蛋白質(zhì)斑點(diǎn),應(yīng)用基
5、質(zhì)輔助激光解吸附飛行時(shí)間質(zhì)譜技術(shù)(MALDI-TOF-MS)進(jìn)行檢測,獲得各蛋白質(zhì)的肽指紋圖譜,結(jié)合2-DE圖譜中各蛋白質(zhì)斑點(diǎn)的pI和MW值,利用Mascot軟件進(jìn)行匹配Genbank數(shù)據(jù)庫進(jìn)行檢索,鑒定大鼠海馬組織差異表達(dá)的蛋白質(zhì),探討GRb1對CL致癇大鼠海馬神經(jīng)元蛋白質(zhì)組的影響。 結(jié)果:①大鼠的行為學(xué)表現(xiàn),參照Dieh1的癲癇分級標(biāo)準(zhǔn),對照組大鼠均未見癲癇發(fā)作;CL致癇組大鼠6例均出現(xiàn)Ⅲ-Ⅴ級發(fā)作,平均可達(dá)Ⅳ級。GRb1+
6、CL致癇組大鼠4例未見明顯癲癇發(fā)作,2例動物出現(xiàn)Ⅰ-Ⅱ級小發(fā)作。②海馬神經(jīng)元HE染色顯示,對照組大鼠海馬神經(jīng)細(xì)胞排列整齊,邊緣清晰,形態(tài)正常;CL致癇組大鼠可見海馬神經(jīng)元受到損害,尤以CA3區(qū)和齒狀回最明顯,神經(jīng)元細(xì)胞腫脹,排列不整齊、稀疏,胞漿濃縮、深染,胞核固縮;GRb1+CL致癇組大鼠海馬神經(jīng)元CA1到CA4區(qū)及齒狀回細(xì)胞排列緊密、規(guī)則,細(xì)胞形態(tài)正常。③獲得重復(fù)性較好的大鼠海馬組織蛋白質(zhì)雙向電泳圖譜。④篩選出6個表達(dá)明顯變化的蛋白
7、點(diǎn)并獲得這些蛋白質(zhì)的肽質(zhì)量指紋譜,成功鑒定出6個蛋白質(zhì),分別是:腦肌酸激酶(Brain creatine kinase)、吞蛋白A1(Endophilin-A1)、UPF0628蛋白C10orf96同源物(UPF0628 protein C10orf96 homolog)、細(xì)胞色素P-450(CytochromeP-450)、磷導(dǎo)素樣蛋白(Phosducin-like protein)及橋整合蛋白3(Bridging integrato
8、r3)。其中前三個蛋白質(zhì)在GRb1+CL致癇組表達(dá)低于CL致癇組,后三個蛋白質(zhì)在GRb1+CL致癇組表達(dá)低于對照組。 結(jié)論:①GRb1可減輕CL所致大鼠癲癇的發(fā)作程度和海馬神經(jīng)元的損傷。②CL致癇組、GRb1+CL致癇組和對照組的表達(dá)蛋白質(zhì)組相比存在明顯差異。鑒定出的6個差異表達(dá)的蛋白質(zhì)可能與GRb1的神經(jīng)保護(hù)作用有關(guān),其中Brain creatine kinase、Endophilin-A1、UPF0628 protein C
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